养殖可口革囊星虫纤溶酶分离纯化及酶学特性研究

2021-11-23蔡彬新周逢芳阮少江黄伟卿刘聪颖

水产科学 2021年6期

蔡彬新，周逢芳,3，阮少江，黄伟卿,3，刘聪颖，苏愉

( 1.宁德师范学院生命科学学院，福建宁德 352100； 2.海西海洋特色生物种质资源与生物制品开发公共服务平台，福建宁德 352100; 3.闽东水产品精深加工福建高校工程研究中心，福建宁德 352100 )

血管内血栓是心脏血管疾病的主要原因，严重危害人体健康[1]。在某些特定的生理条件下，机体纤溶作用效率低，血管内纤维蛋白积聚，阻碍血液流动[2]。目前临床使用的抗血栓药物主要有抗血小板药物、抗凝剂和溶栓剂等[3-4]。然而，这些药物成本高、作用时间短、缺乏特异性、具有毒性及其他各种副作用[5-6]。因此，人们正在积极寻找各种来源的新型纤溶酶。据报道，目前已从海洋动物[7-9]、微生物[10-11]中分离出纤溶酶。

海洋作为人类药物的重要宝库，海洋药物具有结构新颖、活性高、副作用低等优点。海洋底栖动物可口革囊星虫(Phasclosomaesculenta)被称为海洋“冬虫夏草”，具有活血强身及补肾益智等功效[12-13]。Ge等[8,14-15]研究发现，可口革囊星虫肠内存在纤溶酶，具有开发前景。由于野生可口革囊星虫日趋减少，而对表达出的星虫纤溶酶蛋白活性不理想[16]，限制了星虫纤溶酶的开发。随着星虫养殖技术的突破，星虫资源充足，研究养殖可口革囊星虫体内纤溶酶活性有重要意义。笔者自养殖的可口革囊星虫体内分离纯化纤溶酶，进一步研究其酶学特性，为养殖可口革囊星虫纤溶酶的开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

养殖可口革囊星虫来自宁德宏远水产有限公司星虫养殖场。

凝血酶、纤维蛋白原、尿激酶购于Sigma公司；Q-Sepharose Fast Flow、Sephcry1 S-100购于GE公司；Bradford试剂盒购于碧云天公司；蚓激酶购于长春国奥药业公司；其余药品为分析纯，购于国药试剂公司。

1.1.2 仪器

AKTA蛋白层析系统(美国GE公司)；FDU-2110冷冻离心机(日本东芝公司)；Varioskan LUX酶标仪(美国Thermo公司)；冻干机FDU-1200(日本东京理化)；3-16PK高速冷冻离心机(德国Sigma公司)；电泳装置(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 纤溶酶活性测定

参照文献[17]纤维蛋白平板法测定纤溶酶活性。以标准尿激酶活性的对数为横坐标，以溶圈面积的对数为纵坐标，制作纤溶酶活性标准曲线，计算纤溶酶的活性。

1.2.2 蛋白质含量测定

参照试剂盒采用Bradford法测定蛋白质含量。

1.2.3 星虫纤溶酶活性部位筛选

将星虫洗净剖开取食道、肠、体液3部分，冷冻干燥。用Tris缓冲液(0.02 mol/L，pH 7.5)配成10 mg/mL的液体，取10 μL于平板内进行活性检测，阴性对照为Tris缓冲液，阳性对照为10 mg/mL的蚓激酶，确定星虫纤溶酶活性部位。

1.2.4 星虫纤溶酶分离纯化

1.2.4.1 硫酸铵盐析

取肠组织，加入一定体积的Tris缓冲液，匀浆，4 ℃、10 000 r/min(离心半径13.5 cm)离心10 min，取上清液，平均分为9份，每份10 mL，加入不同质量的固体硫酸铵，饱和度分别至10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%，缓慢搅拌均匀，4 ℃静置过夜，离心收集沉淀，用截留分子质量为5 ku的透析袋透析除盐，测定纤溶酶活性和蛋白质含量，确定最佳硫酸铵盐析质量分数。

1.2.4.2 Q-Sepharose Fast Flow层析

取最佳范围盐析所得粗酶，用Tris缓冲液配成10 mg/mL的溶液，加载到Q-Sepharose Fast Flow柱上(1.5 mm×20 cm)，Tris缓冲液平衡，分别用浓度为0.1、0.2、0.3、0.5 mol/L NaCl的Tris缓冲液洗脱结合蛋白，流速为1 mL/min，收集蛋白洗脱峰，测定纤溶酶活性和蛋白质含量。

1.2.4.3 Sephcry1 S-100凝胶层析

将Q-Sepharose Fast Flow分离出活性较高的酶，加载到Sephcry1 S-100柱上(1.0 mm×40 cm)，用Tris缓冲液洗脱，洗脱速度1 mL/min，收集蛋白洗脱峰，测定纤溶酶活性和蛋白含量。

1.2.5 相对分子质量及MALDI-TOF MS测定

采用SDS-PAGE电泳法测定星虫纤溶酶的纯度及相对分子量。分离胶含量12%，浓缩胶含量5%，上样量为20 μL，浓缩胶电压100 V，分离胶电压120 V。纯化得到纤溶酶PK，经切胶，送上海鹿明生物科技有限公司进行MALDI-TOF质谱鉴定，检索美国国立生物技术信息中心数据库。

1.2.6 星虫纤溶酶酶学性质研究

用Tris缓冲液(0.02 mol/L，pH 7.5)配置10 mg/mL纤溶酶溶液，考察pH、温度、金属离子对酶活性的影响。在pH 3、4、5、6、7、8、9、10及37 ℃条件下孵育1 h，孵育后将所有样品的pH均调为7.5，测残余纤溶酶活性。将10 mg/mL纤溶酶分别于4、37、50、60、70 ℃下孵育1、2、3、4、5 h后，测残余纤溶酶活性。于10 mg/mL纤溶酶溶液中加入Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Al3+，使其含有0.15 mol/L的金属离子。以不加金属离子的纤溶酶溶液作为对照组，37 ℃孵育1 h后，测残余纤溶酶活性。

1.2.7 星虫纤溶酶对体外凝血块的溶解作用

小鼠断头取血，体外制备血凝块。称量质量后放入试管中，随机分为9组，以生理盐水为阴性对照组，蚓激酶(10 mg/mL)为阳性对照组，10 mg/mL星虫纤溶酶为试验组，每组反应1、2、3 h。按血凝块质量分别加入等质量溶液，置37 ℃水浴，轻轻振荡，定时观察凝血块溶解现象，计算溶解率(R，%)。

R=(m1-m2)/m1×100%

式中，m1为试验前血块质量(g)，m2为试验后血块质量(g)。

2 结果与分析

2.1 纤溶酶活性标准曲线

以标准尿激酶活性对数为横坐标，溶圈面积对数为纵坐标作图(图1)。标准曲线方程为：y=0.3118x+1.8346，r2=0.9973，依此方程计算纤溶酶活性。

图1 尿激酶标准曲线Fig.1 The standard curve of urokinase

2.2 不同部位匀浆液纤溶酶活性

用纤维蛋白平板检测不同部位匀浆液纤溶酶活性，结果见图2。体液、肠和食道3个部位中，肠匀浆液中溶圈最大，表明肠组织中纤溶酶活性最强，纤溶酶主要存在于星虫的肠部位中。

图2 可口革囊星虫不同部位纤溶酶活性Fig.2 Fibrinolytic activity of different parts of sipunculid P. esculenta1.阴性对照； 2.阳性对照； 3.体腔液； 4.肠； 5.食道.1.negative control； 2.positive control； 3. coelomic fluid; 4.intestine; 5.esophagus.

2.3 星虫纤溶酶分离纯化

星虫纤溶酶初提液经10%～90%饱和度硫酸铵盐析，沉淀的纤溶酶活性见图3。硫酸铵饱和度小于20%时，沉淀的纤溶酶活性很小；饱和度在40%～70%时，沉淀的纤溶酶活性随着饱和度的增加而快速增加；饱和度大于70%时，纤溶酶活性开始减弱。因此，确定用40%～70%的饱和度硫酸铵进行盐析。

图3 纤溶酶盐析曲线Fig.3 Salting out curve of the fibrinolytic enzyme

盐析出的粗酶液经Q-Sepharose Fast Flow层析的结果见图4。4个洗脱峰中，第4峰具有较大纤溶活性。收集第4峰活性峰，经S-100凝胶层析结果见图5。2个洗脱峰中，第1峰具有纤溶活性，收集活性的峰1，为纤溶酶。根据尿激酶标准曲线，计算酶活性，结果见表1。从肠匀浆液分离出的纤溶酶，酶活性为4343.12 U/mg，是粗提物酶活性的13.82倍，但总酶活性回收率只有3.83%。

图4 Q-Sepharose FF交换层析 Fig.4 Lon-exchange chromatography on Q-Sepharose FF

图5 Sephcry1 S-100凝胶过滤层析Fig.5 Gel chromatography on Sephcry1 S-100

表1 可口革囊星虫纤溶酶分离纯化结果

2.4 纤溶酶纯度及相对分子质量测定

纤溶酶分离纯化的各组分经SDS-PAGE电泳，结果见图6。40%～70%饱和度硫酸铵盐析后的蛋白条带较多，Q-Sepharose Fast Flow层析后有3个明显的条带，而经Sephacryl S-100 凝胶层析后只剩1个条带，分子质量为32 ku。纯化到的纤溶酶经MALDI-TOF质谱分析和美国国立生物技术信息中心数据库比对，未找到相似的蛋白酶。

图6 不同分离组分电泳Fig.6 Electrophoretogram of different components1.maker； 2.S-100层析； 3.QS-FF层析; 4.盐析； 5.粗提物.1.maker; 2.S-100 chromatography; 3.QS-FF chromatography; 4.salting out; 5.crude extract.

2.5 星虫纤溶酶的酶学性质

2.5.1 温度对星虫纤溶酶活性的影响

纤溶酶PK在4 ℃和37 ℃保温5 h，酶的活性基本保持不变(P>0.05)(图7)；在50 ℃时，随着保温时间的延长，残余的酶活性显著降低(P<0.05)，5 h后仅剩23.12%；在60 ℃保温1 h后，残余酶活性只剩27.41%；70 ℃时酶几乎完全失活。说明该纤溶酶有一定的热稳定性，但对高温较敏感。

图7 温度对纤溶酶PK活性的影响Fig.7 Effect of temperature on activity of fibrinolytic emzyme PK柱状图上不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同.Different letters in the same column indicate significant differences (P<0.05), et sequentia.

2.5.2 pH对星虫纤溶酶活性的影响

该纤溶酶活性在pH 6～9保持相对稳定，残留酶活性在90%以上，最适pH为7(图8)。当pH小于6或大于9酶活性均显著下降(P<0.05)；当pH为3时，相对酶活性降至10.2%，当pH为10时，酶完全失活，说明该酶在碱性环境下更易失活。

图8 pH对纤溶酶PK活性的影响Fig.8 Effect of pH on activity of fibrinolytic emzyme pK折线图上不同字母表示差异显著(P<0.05).Different letters in the same column indicate significant differences (P<0.05).

2.5.3 金属离子对星虫纤溶酶活性的影响

Mg2+能提升该纤溶酶的活性(P<0.05)，Fe2+、Cu2+、Al3+显著抑制该酶的活性(P<0.05)，其他离子没有明显的促进或抑制作用(P>0.05)(图9)。

图9 金属离子对纤溶酶PK活性的影响Fig.9 Effect of metal-ions on activity of fibrinolytic emzyme pK

2.6 星虫纤溶酶体外溶解血凝块

生理盐水组各时间点血凝块溶解率无显著变化(P>0.05)，阳性对照组和纤溶酶组随着时间的增长，血凝块溶解率增大，阳性对照组在3 h时溶解率达到100%，而纤溶酶组最大为88.09%(图10)。阴性和阳性对照组溶液呈鲜红色，而纤溶酶组呈暗红色(图11)。

图10 纤溶酶PK体外溶解血凝块结果Fig.10 Effects of thrombolysis of fibrinolytic emzyme PK in vitro柱状图上不同小写字母表示同一组不同时间差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示不同组别同一时间差异显著(P<0.05).Different letters in the same column indicate significant differences in the same group at different time (P<0.05). differentt capital letters in the same column indicate significant differences in the different groups at the same time (P<0.05).

图11 星虫纤溶酶PK体外溶解血凝块现象Fig.11 The phenomenon of thrombolysis in fibrinolytic emzyme PK of sipunculid in vitroa.阴性对照组； b.阳性对照组； c.纤溶酶PK组.a.negative control group; b.positive control group; c.fibrinolytic emzyme PK group.

3 讨论

3.1 星虫纤溶酶活性部位选取

自然界中存在着许多具有溶栓效应的天然活性物质。溶栓药蚓激酶上市以来，人们不断在寻找纤溶活性强、药理作用广、稳定性好、副作用小的溶栓药。海洋作为人类药物的重要宝库，目前已从可口革囊星虫[14-16]、裸体方格星虫(Sipunculusnudus)[17-19]等海洋生物中分离出纤溶酶。但野生星虫等海洋生物资源有限，过度采挖，资源已经越来越少。目前可通过蛋白表达技术产生大量目标蛋白酶，但研究发现，原核表达的纤溶酶没有活性，而真核系统表达的酶活性很小[16]，只能以养殖星虫为原料提取纤溶酶。本试验中，养殖可口革囊星虫不同组织中肠组织纤溶酶活性最强，食道提取液活性较小，因此纤溶酶主要存在肠道中，可能与肠是主要的消化器官且内含丰富的消化酶有关。

3.2 星虫纤溶酶纯化工艺

为得到高纯度的纤溶酶，以纯化步骤少、操作过程低温为原则，采用盐析、Q-Sepharose Fast Flow阴离子和Sephcryl S-100凝胶层析组合的分离方法，从养殖可口革囊星虫肠中分离到纤溶酶。在盐析过程中，要边加硫酸铵边搅拌，以免硫酸铵沉淀及局部盐度升高使酶失活。盐析的关键是盐含量区间的设置，既要考虑蛋白的回收率，也要考虑酶的高活性。本试验中，硫酸铵饱和度40%～70%沉淀区间，纤溶酶活性急剧上升，此区间为盐析目的酶的最优区间。马伏宁等[9]用30%～70%饱和度的硫酸铵从方格星虫中盐析出纤溶酶；李冠龙等[20]用40%～70%饱和度的硫酸铵从茶树菇子实体中盐析出纤溶酶，可以看出，纤溶酶的来源不同，但盐析的区间较为一致，这可能与纤溶酶蛋白的特性相关。

离子交换层析是蛋白纯化常用的方法，影响纯化效果的因素主要有填料类型、缓冲液的含量及pH等。本试验中，笔者采用Q-Sepharose Fast Flow强离子吸附剂填料。已报道的纤溶酶蛋白等电点在4～7间，因此用pH 8.5的缓冲液进行洗脱，通过Q-Sepharose Fast Flow分离，取得了较好的分离效果。此步骤酶总活性回收率为14.65%，损失较多，可能是纤溶酶蛋白未完全吸附到填料上，直接洗脱流失，还有可能是洗脱出的目标峰溶液经过脱盐处理后流失，后期可进一步优化缓冲液pH和洗脱流速等参数。凝胶层析作为蛋白分离纯化的精细步骤，Sephcryl S-100分离后，回收率为3.83%。经过上述纯化工艺路线，得到的活性为4343.12 U/mg，比肠匀浆原液酶的活性提高了13.82倍，与牛荣丽等[14]研究相比，总酶活性回收率偏低。这可能是由纯化时原样品总量较少，且盐析含量范围选择的不够宽及离子层析参数不够恰当等导致，后期需进一步优化。

3.3 星虫纤溶酶特性及溶血能力

牛荣丽等[14,21-23]从不同动物中纯化得到的纤溶酶，其分子质量为32～35 ku，与本试验分离到的纤溶酶分子质量32 ku相似。虽然纤溶酶蛋白分子质量与其他学者研究的相似，但通过MALDI-TOF质谱分析和美国国立生物技术信息中心数据库比对，未找到相似的蛋白，因此后续试验要进一步确定蛋白的序列。研究发现，纤溶酶在pH 6～9时，稳定性较好；pH超过9时，酶活性快速下降。常温下酶活性相对稳定，但不耐高温，与之前研究过的动物纤溶酶的pH相当[14]，适用于人体。反应体系中含有Mg2+时，纤溶酶的酶活性表现为激活作用，而在张雪等[24]的研究中，Mg2+对豆豉纤溶酶起抑制作用。可见，同一种金属离子对不同的纤溶酶会产生不同的作用。体外溶解血凝块发现，分离到的纤溶酶溶解血凝块的能力与蚓激酶相当，但溶解出的血液颜色变深，原因待后续进一步探究。本试验中，从养殖可口革囊星虫肠组织中纯化出的纤溶酶，与从野生星虫等其他动物中分离出的具有同等性质及功效，为养殖可口革囊星虫纤溶酶的开发应用，提供了丰富的原料资源。