超声-微波协同提取紫云英籽油及脂肪酸组成分析

蒋新龙 蒋益花 张雨生

(浙江树人大学生物与环境工程学院，杭州 310015)

紫云英 (Astragalussinicus) 是豆科黄芪属越年生草本植物，是南方稻区最主要种植和利用的绿肥作物，也是很好的蜜源植物与重要的青贮饲料原料来源[1]，还是美味蔬菜和制茶的原料，其根、茎、叶均具有一定的药用价值[2，3]，其种子具有祛风明目之功效[4]。对于紫云英种子的研究主要集中在新品种选育与鉴定[5]和提高种子发芽率方法[6，7]。目前，关于紫云英籽油的研究鲜见报道。为了科学、充分地利用紫云英籽油资源，对微波-超声协同辅助提取紫云英籽油工艺进行优化，并通过GC分析其籽油脂肪酸组成，为进一步开发利用提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫云英籽：市售。采用OLYMPUS DP72显微镜观测，基本上为肾形，种子平均千粒重为3.25 g。紫云英籽经拣选、干燥、粉碎后制成40～60目籽粉，备用。37种脂肪酸混合标准品，其他试剂均为分析纯。

CW-2000微波-超声协同萃取仪，Agilent 7890B气相色谱仪，UV-1600型紫外/可见分光光度计，AB204型分析天平，RV10旋转蒸发仪。

1.2 紫云英籽油超声-微波协同提取条件的优化

1.2.1 提取方法

紫云英籽→除杂→烘干→粉碎→过筛→称重→加提取溶剂→微波-超声协同萃取→抽滤→旋蒸除去溶剂→干燥→紫云英籽油。

精密称取3.000 0 g的籽原料，置于100 mL仪器专用萃取瓶中，加入适量溶剂后搅拌使样品良好分散于溶剂中。将萃取瓶置于仪器萃取炉腔中，安装好冷凝回流装置，分别设置微波功率、提取时间等参数，检查完毕后开启微波及超声(固定超声条件：超声输出功率50 W，频率40 kHz)进行萃取。萃取结束后进行减压抽滤，滤液用旋转蒸发器浓缩，浓缩物放恒温鼓风干燥箱干燥(110 ℃加热30 min)，精密称量。每组实验重复3次，取平均值。按公式计算紫云英籽油的出油率。

式中：M为紫云英籽的质量/g；M2为空瓶质量/g；M1为空瓶和紫云英籽油的质量/g。

1.2.2 提取优化实验

理想提取溶剂的确定：分别以正己烷、石油醚(60～90 ℃)、丙酮、无水乙醇作为提取溶剂，在微波功率200 W，提取时间120 s，液料比10 mL·g-1的条件下进行萃取，以油脂品质、出油率、溶剂价格、溶剂毒性为综合考察指标，确定理想的提取溶剂。

单因子实验：采用1.2.1超声-微波协同提取法，提取条件：微波功率200 W、液料比10 mL·g-1，考察提取时间(60、90、120、150、180、210 s)对出油率的影响；提取时间150 s，液料比10 mL·g-1，考察微波功率(0、50、150、200、250、300 W )对出油率的影响；提取时间150 s、微波功率200 W，考察液料比(6、8、10、12、14、16 mL·g-1)对出油率的影响。

响应面实验：根据提取时间、液料比以及微波功率3个单因子实验结果，确定响应面实验因素水平，见表1。用Design-Expert软件设计响应面实验，选用Box-Behnken实验设计，做3因素3水平共 17个实验点(5个中心点)的响应面分析实验。

表1 响应面方案设计因素水平表

1.3 紫云英籽油理化性质分析

密度测定采用GB/T 5526—1985法；折光率测定采用GB/T 5527—2010法；酸价测定采用GB/T 5009.229-2016法；过氧化值测定采用GB 5009.227—2016法；碘值测定采用GB/T 5532—2008法；苯并(α)芘测定采用GB/T 22509—2008。平行3次，取平均值。

1.4 紫云英籽油的GC 成分分析

脂肪酸组成参照 GB/T 5009.168—2016的外标法，用Agilent 7890B气相色谱仪进行GC 成分测定。

GC分析条件：色谱柱：CNW CD-2560(100 m×0.25 mm×0.20 μm)；检测器类型：FID；检测器温度：260 ℃；进样口温度：250 ℃；进样量：1 μL；升温程序：130℃保持5 min，再以4 ℃/min的速率升温至240 ℃并保持30 min；分流比∶10∶1；载气流速：0.5 mL/min。

1.5 统计方法及分析软件

以上指标均重复测定3次并取平均值，利用Origin8软件作图；应用SPSS20.0软件进行数据统计，并用Duncan多重比较(SSR法)检验各处理平均数之间的差异显著性(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 提取优化实验

2.1.1 提取溶剂的选择

传统浸提方法所用的溶剂不一定适合微波辅助提取[8]。微波辅助技术是利用微波场的体积加热和选择性加热的功能。微波辅助提取溶剂的选择不仅要考虑相似相容规律，还要考虑微波高选择性加热特点。溶质和溶剂的极性越大，对微波能的吸收越大，升温越快，对萃取越有利[9]。表2结果表明：相同提取条件，出油率从大到小依次为石油醚、丙酮、无水乙醇、正己烷。从提取的油脂品质考虑，石油醚和正己烷提取的油脂色泽浅、澄清度高，杂质少。综合各方面考虑选用石油醚(60～90 ℃)作为提取溶剂。

表2 不同有机溶剂对提取的比较

2.1.2 单因素实验

图1可知，紫云英籽油的出油率随提取时间的延长而增大，提取时间为150 s时，紫云英籽油的出油率最高。谢明勇等[9]研究表明，在微波萃取过程中，一般加热1～2 min即可达到所要求的萃取温度，不同的物质，最佳萃取时间不同。本实验的最佳提取时间为150 s。

由图1可知，随微波功率的增大，紫云英籽油出油率不断增大，当微波功率达到200 W时，紫云英籽油的出油率达到最高。微波功率越大，物料内部温度升高越快，局部压力变大，导致细胞破裂，内容物透过细胞壁流出并溶解到溶剂中的传递速度越快[10]。在微波功率达到 200 W 之后， 高微波功率导致的热效应使油分解或挥发，导致出油率有所减少[11]。

由图1可知，随着液料比的增加，紫云英籽油出油率不断增大，在液料比达到10∶1mL·g-1时，出油率最高。提取溶剂用量的增加，增加了溶剂与紫云英籽细胞中油脂的浓度差，增加了传质推动力，从而提高了油脂在提取剂中的扩散速度。当溶剂用量增大到一定程度后，紫云英籽油的出油率逐渐减少，这是因为当溶剂过大时，相同时间提供的热量被提取溶剂吸收的比例增加，空化效应和机械效应等作用的强度减弱，影响提取效率，而且溶剂用量过大，会造成溶剂回收困难和生产成本增加。由图1可知，液料比10 mL/g较为适宜。

图1 微波-超声协同提取紫云英籽油单因子实验结果

2.1.3 相应面实验

2.1.3.1 实验结果

响应面实验数据见表3。

2.1.3.2 方差分析

响应面实验结果见表3。采用Designexpert软件对所得数据进行回归分析，回归结果见表4。从表4中可以看出，提取时间(A)的P<0.05，说明提取时间对籽油的提取影响显著，微波功率(B)和液料比(C)P>0.05，说明微波功率和液料比对籽油的提取影响都不显著。方差分析说明各个实验因子对籽油的提取影响由大到小的顺序依次为：提取时间(A)、液料比(C)、微波功率(B)。方差分析也说明各个具体实验因子与响应值都不是简单的线性关系。

2.1.3.3 拟合模型的建立

对响应面测试数据进行回归拟合，确立回归方程：Y/% =+31.41+0.46A+0.19B-0.22C+0.15AB+0.43AC+0.26BC-2.57A2-2.03B2-1.21C2

2.1.3.4 交互作用分析

在提取时间、液料比、微波功率3个因素中任取两个作为X和Y，以出油率作为Z，作出相应的三维曲面图。相比而言，提取时间(A)和液料比(C)的交互作用较大，如图2，表现为曲线比较陡，这与回归分析的结果吻合。等高线的形状也可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。图2可知，提取时间(A)和液料比(C)的交互作用较大。

2.1.3.5 最优工艺验证

利用软件绘出回归模型的等高线，并确定模型的极大值点，预测所得最大籽油出油率为31.45%。利用软件得出籽油提取的最优条件：微波功率204.41 W、液料比9.86 mL·g-1、提取时间152.54 s。

图2 三维曲面和回归模型等高线

结合实际实验条件，得到最优条件为微波功率204 W、液料比10 mL·g-1、提取时间152 s。根据实际最优工艺进行验证实验，在此条件下测定籽油出油率，平行3次，得最大出油率为31.52%。根据预测最优条件进行验证实验，实验结果与预测值无显著差异。根据GB/T 14772—2008粗脂肪测定方法，测得紫云英籽粗脂肪含量为32.16%，而本最优工艺得最大出油率为31.52%，说明籽油基本上已经提取完全，所以微波-超声协同辅助法是短时高效提取紫云英籽油的方法。

2.2 紫云英籽油理化性质

酸值是衡量油脂新鲜程度的指标，酸值越小，说明油脂中游离脂肪酸含量越小，油脂越新鲜[12]。由表5可知，紫云英籽油的酸值(KOH)为 2.61 mg/g，低于3.00 mg/g，符合GB/T 2716—2018食用植物油国家标准。过氧化值是衡量油脂被氧化的程度。长期食用过氧化值超标的油脂，对癌症肿瘤、心血管病等慢性病有促进作用[13]。过氧化值数值越高，油品越差，紫云英籽油的过氧化值为7.72 mmol/kg，紫云英籽油的过氧化值低于食用植物油国家标准。碘值是判断油脂脂肪酸不饱和程度的指标，紫云英籽油的碘值为130.2 gI/100 g，属于干性油，说明紫云英籽油不饱和程度较高。此外，紫云英籽油相对密度为 0.899 0，所制紫云英籽油为澄清透明的黄色液体。以测定的理化指标判断，紫云英籽油达到食用植物油国家标准。

表5 紫云英籽油理化特性

注：GB/T 2716—2018标准要求：酸值/mgKOH/g≤3；过氧化值/g/100 g≤0.25，即过氧化值/mmol/kg≤9.85。

2.3 紫云英籽油脂肪酸组成及含量分析

根据1.4方法，对紫云英籽油进行GC分析，紫云英籽油的脂肪酸组成分析结果见和表6。由表6可知，从紫云英籽油中共鉴定出20种脂肪酸，脂肪酸组成非常丰富。主要脂肪酸为亚油酸(37.58%)、亚麻酸(30.03%)、油酸(13.24%)、棕榈酸(10.56%)、硬脂酸(3.48%)、芥酸(1.11%)，6种主要脂肪酸含量占95.99%。紫云英籽油不饱和脂肪酸含量为82.83%，以不饱和脂肪酸为主，这一结果验证了紫云英籽油具有较高的碘值。

亚麻酸(ω-3)可代谢为人体必需的EPA和DHA，具有预防老年痴呆、抗炎、降糖、降压等作用[14]。亚油酸(ω-6)是人体合成前列腺素的前体物质，亚油酸的主要功效体现在预防心血管疾病上[15]。因为亚麻酸和亚油酸在人体中均接受不饱和化酶和碳链延长酶的作用，如果亚油酸摄入过量，会导致亚麻酸无法吸收[16]。亚油酸和亚麻酸比例过高将引起动脉紧缩、引发亚麻酸缺乏症及多种退化性疾病。较低亚油酸和亚麻酸比例则有助于抗炎和抗癌[16]。中国营养学会在《中国居民膳食营养素参考摄入量》一文中提出亚油酸和亚麻酸适宜比例为(4～6)∶1[16-17]。当今人类饮食中亚油酸和亚麻酸比例已经高达(10～30)∶1，文献表明，ω-6/ω-3的最佳比值为1～4，ω-6 /ω-3比值降低，可以更好地减缓癌症的发展，降低心血管疾病的风险，改善骨骼健康[18]。紫云英籽油中，亚油酸(ω-6)与α-亚麻酸(ω-3)的比值为1.25。紫云英籽油的摄入可以降低膳食中ω-6/ω-3脂肪酸的比值。紫云英籽油含有丰富的亚油酸与α-亚麻酸，而且具有较低的ω-6 /ω-3比值，因而具有较高的营养价值和开发利用价值。

表6 紫云英籽油脂肪酸组成

3 结论

在单因素实验基础上，运用响应面设计的理论与方法，确定最佳提取工艺：石油醚为提取剂，提取时间152 s，微波功率204 W，液料比10 mL·g-1。在此条件下，紫云英籽油出油率为31.52%。经方差分析和响应面图得知，在本实验范围内，各因素对紫云英籽油提取率的影响作用大小顺序为提取时间>液料比>微波功率，且提取时间对紫云英油的提取影响显著，三因素之间的交互影响都不显著。实验证明，响应面分析法可以有效地优化超声-微波协同提取法提取紫云英籽油的工艺条件。本实验建立的优化模型对紫云英籽油的开发利用具有指导意义。

紫云英籽油的理化指标达到GB / T 2716—2018《食品安全国家标准 植物油》。GC 分析得到紫云英籽油主要成分有油酸、亚油酸、亚麻酸、棕榈酸、硬脂酸、芥酸，以多不饱和脂肪酸油酸为主，不饱和脂肪酸占82.83%。亚油酸(ω-6)与α-亚麻酸(ω-3)的比值为1.25。紫云英籽油具有较高的利用价值，可作为优质食用油源和功能性食用油开发利用。