N-（三氘代甲氧羰基）-L-缬氨酸的合成*

丰巍伟，刘 飞，徐云根，朱雪焱，张寅生

1正大天晴药业集团股份有限公司，南京 211122；2 中国药科大学 药学院，南京 211198；3中国医药工业总院上海医药工业研究院，上海 201203

盐酸达卡他韦（daclatasvir dihydrochloride，a），化学名为N，N’-[[1，1’-联苯]-4，4’-二基双[1H-咪唑-5，2-二基-（2S）-2，1-吡咯烷二基[（1S）-1-（1-甲基乙基）-2-氧代-2，1-乙烷二基]]]双氨基甲酸二甲酯二盐酸盐，是百时美施贵宝公司研制开发的HCV NS5A抑制剂[1]，于2014年8月获EMA批准上市，是首个用于治疗HCV感染的NS5A抑制剂，对HCV基因1-6型均有较好的治疗效果[2，3]。

本公司自主研发的1类新药氘代达卡他韦[4]（Deudaclatasvir，b）与达卡他韦的作用机制相同，结构式见图1，通过与HCV病毒NS5A蛋白结合发挥药效作用，药理毒理实验表明，两者的药效相当，药代行为及毒性反应基本相似，氘代达卡他韦拥有较高的成药性，该产品目前正在国内进行I期临床试验。

在氘代达卡他韦的合成过程中，最关键的是其氘代片段N-（三氘代甲氧羰基）-L-缬氨酸（1）的制备。先前开发的合成方法[4]（见图2）利用三光气和氘代甲醇，制备氘代氯甲酸甲酯，再与L-缬氨酸（2）反应，生成目标产物（1），总收率14%（以氘代甲醇计）。该路线对环境污染较大，存在明显的缺陷：①三光气虽然比光气安全，但难免在使用过程中会产生少量的光气，特别在炎热的夏天为甚；②大量使用了吡啶（Py）；③参考氯甲酸甲酯的毒性，氘代氯甲酸甲酯亦是剧毒品。上述三者均对环境污染较大，安全隐患大，不利于劳动保护。

N，N’-羰基二咪唑（CDI）被广泛应用于酰胺、多肽、氨基甲酸酯等的合成[5]。利用该方法改进了氘代片段（1）的合成，见图3。用对溴溴苄保护N-叔丁氧羰基-L-缬氨酸（3）的羧基，得到化合物（4），再用盐酸脱去Boc保护基制备（5），CDI先与氘代甲醇反应，生成活性中间体咪唑甲酸氘甲酯，再和（5）生成N-（三氘代甲氧羰基）-L-缬氨酸对溴苄酯（6），最后钯碳加氢脱苄酯，得氘代片段（1），4步总收率58%（以氘代甲醇计，收率26%）。若以市售的L-缬氨酸甲酯（5’）代替L-缬氨酸对溴苄酯（5），2步总收率68%（以氘代甲醇计收率30%，是路线1的2倍），收率进一步提高，成本较路线1降低约40%，同时大大降低了对环境的污染，更适合工业化生产。

1 仪器与试剂

Buchi B-545熔点仪；Bruker AV-500、Avance III HD-400M核磁共振仪；Waters Acquity H-Class QDa液质联用仪；AB SCIEX Triple TOF 4600质谱仪；Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪；所用试剂均为分析纯。

2 合成方法

2.1 N-叔丁氧羰基-L-缬氨酸对溴苄酯（4）的合成

将N-叔丁氧羰基-L-缬氨酸（3）（21.73g，0.1mol）溶于150 mL N-甲基吡咯烷酮（NMP）中，加入对溴溴苄（27.49 g，0.11 mol），Cs2CO3（19.55 g，0.06 mol），搅拌，25 ℃反应3 h，薄层色谱（TLC）显示反应完全，向反 应液中加入0.8 L冰水，乙酸 乙酯（AcOEt，200 mL×3）萃取，500 mL饱和NaCl水溶液洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干溶剂，得到化合物4粗品44.40 g，可直接投入下步反应。亦可经硅胶柱层析分离提纯石油醚（PE）与AcOEt为50∶1～20∶1,得到淡黄色浆（4）38.15 g，收率99%，纯度97.8%[HPLC面积归一化法，色谱柱：Waters Sunfire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.01%三氟乙酸-乙腈（80∶20）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长：280 nm；进样量：10 μL]。

1H-NMR（500MHz，CDCl3），δ:0.87（d，J=7.0Hz，3H，CH3），0.96（d，J=6.5Hz，3H，CH3），1.46（s，9H，（CH3）3C），2.15（m，1H，CH（CH3）2），4.27（dd，J=4.5，9.0 Hz，1H，NHCH），5.01（d，J=8.5 Hz，1H，NH），5.09（d，J=12.5 Hz，1H，p-Br-Ar-CH2O），5.17（d，J=12.5 Hz，1H，p-Br-Ar-CH2O），7.25（d，J=8.5 Hz，2H，p-Br-Ar），7.51（d，J=8.5 Hz，2H，p-Br-Ar）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3），δ：17.5，19.0，28.3，31.2，58.6，66.0，79.9，122.5，130.0，131.8，134.5，155.7，172.2。

2.2 L-缬氨酸对溴苄酯（5）的合成

将N-叔丁氧羰基-L-缬氨酸对溴苄酯（4）（37.63 g，0.097 mol）溶于异丙醇（200 mL）中，室温搅拌，加入浓盐酸（24 mL，0.292 mol），加热到60℃，反应7 h，TLC显示反应完全，减压旋干异丙醇。加入400 mL饱和碳酸钠水溶液，AcOEt（200 mL×3）萃取，300 mL饱和NaCl水溶液洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干溶剂，得到化合物5粗品27.48 g，可直接投入下步反应。亦可经硅胶柱层析分离提纯（PE∶AcOEt 15∶1～2∶1）,得到淡黄色油状液体（5）26.96 g，收率97%，纯度98.6%（液相方法同上）。

1H-NMR（500 MHz，CDCl3），δ：0.89（d，J=7.0 Hz，3H，CH3），0.98（d，J=7.0 Hz，3H，CH3），2.05（m，1H，CH（CH3）2），3.34（d，J=4.5 Hz，1H，NH2CH），5.10（d，J=12.5 Hz，1H，p-Br-Ar-CH2O），5.14（d，J=12.5 Hz，1H，p-Br-Ar-CH2O），7.26（d，J=8.0 Hz，2H，p-Br-Ar），7.51（d，J=8.0 Hz，2H，p-Br-Ar）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3），δ：17.1，19.3，32.2，60.0，65.7，122.4，130.1，131.8，134.8，175.4。

TOF-MS：m/z=286.0[M+H]+。

2.3 N-（三氘代甲氧羰基）-L-缬氨酸对溴苄酯（6）的合成

将CDI（18.64 g，0.12mol）、CD3OD（4.15g，0.12mol）、KOH（0.16 g，2.85 mmol）加入到甲苯（150 mL）中，加热至70 ℃，反应5 h后，加入5（14.31 g，0.05 mol），继续70 ℃反应17 h，冷却到室温，过滤，用甲苯洗涤滤饼，将滤液减压浓缩，经硅胶柱层析分离提纯（PE∶AcOEt 20∶1～10∶1），得到白色固体（6）13.02 g，收率75%，m.p.：49℃～51 ℃。

1H-NMR（500 MHz，CDCl3），δ：0.87（d，J=7.0 Hz，3H，CH3），0.97（d，J=7.0 Hz，3H，CH3），2.18（m，1H，CH（CH3）2），4.34（dd，J=5.0，9.0 Hz，1H，NHCH），5.14（m，3H，p-Br-Ar-CH2O，NH），7.25（d，J=8.5 Hz，2H，p-Br-Ar），7.51（d，J=8.0 Hz，2H，p-Br-Ar）。13CNMR（125 MHz，CDCl3），δ：17.4，19.0，31.2，59.0，66.2，122.6，130.1，131.8，134.4，156.9，172.0。

TOF-MS：m/z=347.1[M+H]+。

2.4 N-（三氘代甲氧羰基）-L-缬氨酸甲酯（6’）的合成

将CDI（18.65g，0.12mol）、CD3OD（4.15g，0.12mol）和KOH（0.22g,4 mmol）加入到甲苯（130 mL）中，70 ℃反应3 h，加入L-缬氨酸甲酯（5’）（6.56 g，0.05 mol），70 ℃继续反应20 h，冷却到室温，过滤，用甲苯洗涤滤饼，滤液浓缩，经硅胶柱层析分离提纯（PE∶AcOEt 20∶1～10∶1），得油状液体（6’）7.69 g，收率80%，纯度98.2%[HPLC面积归一化法，色谱柱：Waters Sunfire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.01%三氟乙酸-乙腈（75∶25）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长：200 nm；进样量：25 μL]。

1H-NMR（500 MHz，CDCl3），δ：0.91（d，J=7.0 Hz，3H,CH3），0.97（d，J=7.0 Hz,3H，CH3），2.16（m，1H，CH（CH3）2），3.75（s，3H，COOCH3），4.29（dd，J=5.0，9.0 Hz，1H，NHCH），5.22（d，J=6.5Hz，NH）。13C-NMR（125MHz，CDCl3），δ：17.5，18.9，31.3，52.1，59.0，156.9，172.7。

TOF-MS：m/z=193.1[M+H]+。

2.5 N-（三氘代甲氧羰基）-L-缬氨酸（1）的合成

方法一：将N-（三氘代甲氧羰基）-L-缬氨酸对溴苄酯（6）（10 g，0.029 mol）溶于THF（100 mL）和水（10 mL）的混合溶液中，加入湿钯碳（3 g，含水60%，钯10%），充氢气，常压下30℃反应2 h。过滤，除去钯碳，滤液加饱和NaCl水溶液（300 mL），AcOEt（150 mL×3）萃取，饱和NaCl水溶液200 mL洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干溶剂，得到化合物1粗品5.5 g。用甲基叔丁基醚（30 mL）重结晶，得到白色结晶粉末（1）4.1 g，收率80%。

方法二：将NaOH（2.91 g，0.073 mol）溶于50 mL水中，加入乙醇（150 mL）和6’（7 g，0.036 mol），室温反应3 h。用5%稀盐酸调pH至4～5，加水150 mL，AcOEt（100 mL×3）萃取，100 mL饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干溶剂，得到化合物1粗品6.6 g。用甲基叔丁基醚（35 mL）重结晶，得到白色结晶粉末（1）5.5 g，收率85%。

1H-NMR（400MHz，CDCl3），δ：0.94（d，J=6.8Hz，3H，CH3），1.01（d，J=6.8 Hz，3H，CH3），2.23（m，1H，CH（CH3）2），4.33（dd，J=4.6，9.0 Hz，1H，NHCH），5.25（d，J=9.2Hz，NH），10.74（br，1H，COOH）.13C-NMR（100MHz，CDCl3），δ:17.5，19.2，31.2，59.0，157.3，177.2。

TOF-HRMS：m/z=179.1106[M+H]+。

m.p.：112～113℃。纯度99.7%[HPLC面积归一化法，色谱柱：Chiral PAK®IA（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：0.05%磷酸-乙腈（76∶24）；柱温：30 ℃；流速：1.0mL·min-1；检测波长：193 nm；进样量：25μL]。R-异构体（N-（三氘代甲氧羰基）-D-缬氨酸）：未检出[HPLC面积归一化法，色谱柱：Chiral PAK®AY-H（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：异丙醇-正己烷-三氟乙酸（25∶75∶0.02）；柱温：35℃；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：202 nm；进样体积：20 μL]。

3 讨论

对L-缬氨酸的羧基分别进行了对溴苄酯（5）和甲酯（5’）保护，再以CDI为活化试剂，2步合成了N-（三氘代甲氧羰基）-L-缬氨酸（1），与之前开发的三光气路线相比，收率提高了2倍，成本降低了约40%，也大大降低了对环境的污染。对溴溴苄是白色针状结晶，可室温储存，廉价易得，与L-缬氨酸生成对溴苄酯，具有荧光，便于液相紫外检测。以市售的L-缬氨酸甲酯（5’）代替L-缬氨酸对溴苄酯（5），最后一步反应甲酯保护基更易于水解脱除，反应收率及经济性进一步提高，更适合工业化生产。