HPLC一测多评法同时测定金蓝清瘟合剂中8种成分含量*

李洪彬，赵兴奎，王 静

1菏泽市中医医院 制剂科，山东菏泽 274035；2 菏泽市食品药品检验检测研究院，山东菏泽 274000

金蓝清瘟合剂为我院院内制剂，全方由板蓝根、连翘、广藿香、防风、黄芪等14味中药材组成，临床上主要用于口腔、手足疱疹、发热等手足口病轻型属湿瘟邪毒、袭肺犯脾证的治疗，效果显著。中药复方制剂由多味药材按照中医理论配伍而成，所含成分复杂，具有多组分、多靶点等特点，通过多种成分间的协同作用，从而达到临床治疗效果。金蓝清瘟合剂现行标准尚未对方中所含药味进行定量控制研究，也仅检索到对其所含单一成分绿原酸的文献报道[1]，为全面评价金蓝清瘟合剂的质量，现以连翘苷为内参物，建立高效液相色谱一测多评法对合剂中8种成分进行质量控制，从而达成质量稳定性和临床疗效的一致性。

1 仪器、药品与试剂

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Sartorius BP211D电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 药品与试剂

对照品：连翘酯苷B（批号111811-201603，纯度96.6%）、（R，S）-告依春（批号111753-201706，纯度100.0%）、连翘酯苷A（批号111810-201707，纯度97.2%）、连翘苷（批号110821-201816，纯度95.1%）均购于中国食品药品检定研究院；广藿香酮（批号PRF8072523，纯度99.0%）购于成都普瑞法科技公司；牛蒡子苷元（批号16081335，纯度99.1%）、新西兰牡荆苷（批号16011122，纯度99.8%）均购于上海同田生物技术股份有限公司；藿香黄酮醇（批号CFS201801，纯度98.0%）购于武汉天植生物技术公司。金蓝清瘟合剂（规格：每瓶装100 mL，批号：20180919、20190222、20190529）为本院制剂。乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯；水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 对照品贮备液和混合对照品溶液的制备

精密称取（R，S）-告依春、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元、新西兰牡荆苷、藿香黄酮醇、广藿香酮对照品各适量，用甲醇制成质量浓度分别为0.268、0.532、1.914、0.718、0.186、0.348、0.162、0.244 mg·mL-1的8种对照品贮备液；精密吸取8种对照品贮备液各2.5 mL，用甲醇稀释至50 mL，制成混合对照品溶液，含（R，S）-告依春13.4 μg·mL-1、连翘酯苷B 26.6 μg·mL-1、连翘酯苷A 95.7 μg·mL-1、连翘苷35.9 μg·mL-1、牛蒡子苷元9.3 μg·mL-1、新西兰牡荆苷17.4μg·mL-1、藿香黄酮醇8.1μg·mL-1、广藿香酮12.2 μg·mL-1。

2.2 供试品溶液和阴性样品溶液的制备

精密吸取金蓝清瘟合剂3.0 mL，用甲醇稀释至25 mL，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，制成其供试品溶液；按照本合剂的处方量分别称取不含板蓝根、连翘、广藿香的阴性样品，再按以上供试品溶液制备方法分别制成阴性样品溶液。

2.3 色谱条件及系统适应性试验

色谱柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～11.0 min，12.0%A；11.0～15.0 min，12.0%A→20.0%A；15.0～27.0 min，20.0%A→38.0%A；27.0～42.0 min，38.0%A→45.0%A；42.0～50.0 min，45%A→12.0%A）；检测波长分别为245 nm[2，3][0～15.0 min检测（R，S）-告依春]、275 nm[3，4]（15.0～27.0 min检测连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元）和309 nm[5，6]（27.0～50.0 min检测新西兰牡荆苷、藿香黄酮醇、广藿香酮）；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL。

精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液及“2.2”项下各溶液适量，依法进样检测，记录色谱图。结果显示，合剂中（R，S）-告依春、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元、新西兰牡荆苷、藿香黄酮醇、广藿香酮的色谱峰与相邻色谱峰均能有效分离，分离度均>1.5，理论塔板数按各成分色谱峰计均≥4500，阴性样品对合剂中8种成分的测定无干扰。见图1。

2.4 线性关系考察

精密吸取“2.1”项下8种对照品贮备液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分别用甲醇稀释定容至20 mL，制成6个线性关系考察用系列混合对照品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样检测（R，S）-告依春、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元、新西兰牡荆苷、藿香黄酮醇、广藿香酮的峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标，各成分质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，结果见表1。上述8种成分在各自质量浓度范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

取“2.1”项下混合对照品溶液适量，重复进样6次，记录（R，S）-告依春、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元、新西兰牡荆苷、藿香黄酮醇、广藿香酮的色谱峰峰面积，各成分峰面积的RSD分别为1.03%、0.97%、0.55%、0.71%、1.24%、1.16%、1.30%、1.19%。

2.6 重复性试验

取同一批次金蓝清瘟合剂样品，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，依法进样检测（R，S）-告依春、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元、新西兰牡荆苷、藿香黄酮醇、广藿香酮的色谱峰峰面积，计算得8种成分含量的RSD分别为1.39%、1.25%、1.08%、1.47%、0.76%、1.59%、0.87%、1.62%。

2.7 稳定性试验

取金蓝清瘟合剂样品的同一份供试品溶液，于0、2、4、6、10、18、24 h进样检测（R，S）-告依春、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元、新西兰牡荆苷、藿香黄酮醇、广藿香酮的色谱峰峰面积，结果本合剂供试品溶液24 h内稳定，8种成分峰面积的RSD分别为1.04%、0.95%、0.58%、0.73%、1.19%、1.14%、1.32%、1.22%。

表1 8种成分的回归方程和线性范围

2.8 加样回收率试验

取已知成分含量的同批供试品9份，每份精密量取1.5 mL，随机分成3组（高、中、低浓度），再精密加入一定量的被测成分对照品。中浓度加入量与所取供试品中待测成分量之比为1∶1，高、低浓度分别为1.5∶1、0.5∶1。

按“2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定，用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。结果所测成分（R，S）-告依春、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元、新西兰牡荆苷、藿香黄酮醇、广藿香酮的平均加样回收率及相对标准偏差（RSD）分别为98.77%（1.06%）；99.96%（0.74%）；100.00%（0.61%）；99.21%（0.82%）；96.98%（1.27%）；97.95%（1.33%）；98.00%（1.52%）；97.74%（1.11%）。

2.9 相对校正因子的测定

精密吸取“2.4”项下6个线性关系考察用系列混合对照品溶液适量，依法进样测定（R，S）-告依春、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元、新西兰牡荆苷、藿香黄酮醇、广藿香酮的峰面积，以连翘苷为内参物，按 照计算公式：fk/s=fk/ fs=（YkXs）/（YsXk）（式中Y代表峰面积，X代表质量浓度，k代表内参物连翘苷，s代表其他7种待测成分）分别计算各种成分的相对校正因子。见表2。

表2 以连翘苷为内参物各成分的相对校正因子

2.10 相对校正因子耐用性考察

2.1 0.1不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响精密吸取“2.1”项下的混合对照品溶液适量，分别在Agilent 1260型、LC-20A型高效液相色谱仪和Waters Symmetry C18、Diamonsil C18、Hypersil C18三 种色谱柱条件下，分别依法进样检测（R，S）-告依春、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元、新西兰牡荆苷、藿香黄酮醇、广藿香酮的峰面积，计算各成分的相对校正因子。见表3。

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响

2.1 0.2不同柱温对相对校正因子的影响 精密吸取“2.1”项下的混合对照品溶液适量，分别在不同柱温（28℃、29℃、30℃、31℃、32℃）条件下，依法进样检测（R，S）-告依春、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元、新西兰牡荆苷、藿香黄酮醇、广藿香酮的峰面积，检测不同柱温对相对校正因子的影响。见表4。

表4 不同柱温对相对校正因子的影响

2.1 0.3不同体积流量对相对校正因子的影响 精密吸取“2.1”项下的混合对照品溶液适量，分别在不同体积流量（0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL·min-1）条件下，依法进样检测（R，S）-告依春、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元、新西兰牡荆苷、藿香黄酮醇、广藿香酮的峰面积，检测不同体积流量对相对校正因子的影响。见表5。

表5 不同体积流量对相对校正因子的影响

2.11 待测组分色谱峰的定位

精密吸取“2.1”项下的混合对照品溶液适量，分别在Agilent 1260型、LC-20A型高效液相色谱仪和Waters Symmetry C18、Diamonsil C18、Hypersil C18三种色谱柱条件下，分别依法进样检测，记录（R，S）-告依春、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元、新西兰牡荆苷、藿香黄酮醇、广藿香酮的色谱峰的保留时间，以内参物连翘苷色谱峰为基准峰，采用相对保留时间值法对各成分色谱峰进行定位。见表6。

表6 各种成分的相对保留时间值

2.12 一测多评法与外标法测定结果比较

取3个批次的金蓝清瘟合剂样品适量，按“2.2”项下方法每个批次平行制备3份供试品溶液，依法进样检测（R，S）-告依春、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元、新西兰牡荆苷、藿香黄酮醇、广藿香酮的峰面积，采用外标法和一测多评法分别计算（R，S）-告依春等8种成分的含量并作比较。见表7。

3 讨论

3.1 指标成分的选择

金蓝清瘟合剂由14味药材组方而成，方中连翘、金银花辛凉透邪清热、芳香辟秽解毒，合为君药。广藿香芳香化浊、发表解暑、和中止呕，茵陈、滑石粉清热利湿、解毒疗疮，防风祛风解表，葛根解肌退热，芦根清热泻火，白芷解表散寒、消肿排脓，合为臣药。板蓝根、拳参解毒利咽、凉血止痛，炒白术、黄芪升阳利湿、健脾益气，合为佐药。甘草调和诸药，为使药。参考中药质量标志物以君臣佐使的确认原则，本合剂选取方中君药连翘所含主要成分连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷和牛蒡子苷元；臣药广藿香所含主要成分藿香黄酮醇和广藿香酮；佐药板蓝根所含主要成分（R，S）-告依春为定量指标成分，以期为全面评价该合剂整体质量提供参考依据。

3.2 流动相的选择

本实验参考相关文献选取乙腈-水[3]、甲醇-水[7]、乙腈-0.2%磷酸水溶液[2，4，5]和乙腈-0.2%甲酸水溶液[6]4个流动相系统进行对比考察，以合剂中待测8个目标成分的分离效果为主要指标，同时兼顾色谱图基线、分析检测时间以及杂质峰干扰等因素，结果发现，乙腈-0.2%磷酸水溶液系统基线平稳且与待测8种成分分离效果较好。先以等度洗脱难以实现对8种成分的有效分离，故而采用梯度洗脱法对流动相中水相和有机相的比例不断摸索优化，最终采用乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相，对金蓝清瘟合剂中8种成分同时进行测定。

表7 两种测定法各成分含量测定结果比较（n=3，mg·mL-1）