五味子丙素抑制脂多糖诱导心肌细胞的炎症反应与细胞焦亡的作用及机制研究

刘力亨

南京医科大学附属儿童医院 药学部，南京 210008

脓毒症引起的心肌病是脓毒症和脓毒性休克的常见并发症之一，其最早的临床表现是心功能不全：左心室扩张和射血分数下降，并伴有细胞炎症、凋亡与焦亡[1-3]。细胞焦亡[4]（pyroptosis）又称细胞炎性坏死，是近年来新发现并证实的一种程序性死亡方式。它依赖于半胱天冬酶（caspase-1）活化并通过切割消皮素（gasdermin D，GSDMD）得到其N端产物（GSDMD-NT），在细胞膜上成孔，使炎症因子如白介素（IL-1β）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）等分泌至细胞外，形成炎症。

五味子丙素（schisandrin C，SchC）是传统中草药五味子中的主要成分之一，它具有多种药理活性，包括抗炎、保肝、抗癌和免疫激活，并且可影响呼吸、心血管和中枢神经系统[5，6]。研究报道，五味子丙素对阿昔洛韦诱导的（NOD-，LRR-and pyrin domain-containing protein 3，NLRP3）炎症小体激活、IL-1β 分泌和细胞焦亡具有缓解作用[8]，但其对于脂多糖（LPS）引起的细胞焦亡的影响尚不明确。现利用小鼠心肌细胞HL-1研究五味子丙素对LPS引起的细胞焦亡和损伤的影响。

1 材 料

五味子丙素（SchC）购自上海陶素生化科技有限公司（61301-33-5；10 mg）；脂多糖（LPS）和二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司。

小鼠心肌细胞HL-1购自美国ATCC公司。DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）高糖培养基购自美国Gibco公司；辣根过氧化酶（HRP）标记山羊抗体兔IgG购自美国Santa Cruz公司；抗微管蛋白（Tubulin）兔单克隆抗体、Caspase1兔多克隆抗体、消皮素D（Gasdermin D，GSDMD）兔多克隆抗体均购自美国CST公司；抗NLRP3兔多克隆抗体购自英国Abcam公司；蛋白电泳、转膜与曝光系统均购自美国Bio-rad公司；IL-1β、HMGB1、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒均购自美国eBioscience公司；小鼠GSDMD特异性siRNA购自上海吉玛制药技术有限公司；脂质体2000（Lipofectamine 2000）购自美国Invitrogen公司。

2 方 法

2.1 SchC的配制

将SchC粉末用DMSO配制成5、10、20、50、100、150、200 mmol·L-1；MTT实验时，加入1 μL各浓度SchC至100 μL培养基中（DMSO浓度为1%）；其余实验，加入1 μL各浓度SchC至1 mL培养基中（DMSO浓度为0.1%）。

2.2 HL-1细胞培养

将HL-1细胞接种到DMEM高糖培养基（含100 μ·mL-1链霉素、100 μ·mL-1青霉素和10%胎牛血清）中培养，每48 h换液1次，2～3 d传代1次，传代2次取生长良好的细胞用于实验。

2.3 MTT法预实验选定SchC浓度

分别取对数生长期HL-1细胞接种于96孔板中，分别加入0、5、10、20、50、100、150、200 μmol·L-1的SchC，在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养24 h。

2.4 分组

①将HL-1细胞分组，设立对照组、LPS（1 mg·L-1）组、LPS（1 mg·L-1）+SchC（5、10、20 μmol·L-1）组，SchC孵育细胞1 h后再经LPS处理24 h、48 h，收集细胞上清液进行ELISA，收集细胞进行Western blot和MTT实验；②将HL-1细胞分组，设立对照组、LPS（1 mg·L-1）组、siGSDMD组、LPS（1 mg·L-1）+siGSDMD组、LPS（1mg·L-1）+siGSDMD+SchC（20μmol·L-1）组，HL-1细胞经GSDMD的siRNA（10 nmol·L-1）处理细胞24 h后再经SchC孵育1 h，最后用LPS处理细胞24 h，收集细胞上清液进行ELISA，收集细胞进行MTT实验。

2.5 MTT法检测细胞增殖情况

采用MTT法，选取对细胞增殖影响小的SchC浓度组进行后续实验。①分别取对数生长期HL-1细胞接种于96孔板中，分别加入5、10、20 μmol·L-1的SchC提前孵育1 h后，加入LPS（1 mg·L-1）处理，在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养24 h或48 h；②分别取对数生长期HL-1细胞接种于96孔板中，GSDMD特异性siRNA处理HL-1细胞24 h后SchC再孵育1 h，加入LPS（1 mg·L-1）处理，在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养24 h或48 h。每孔加人20 μL MTT（5 mg·mL-1）继续培养4 h，离心后小心吸尽上清液，每孔加入150 μL DMSO吹打混匀，采用酶标仪于570 nm处读取各孔吸光度值。按公式AX/ADMSO计算细胞增殖抑制率。

2.6 ELISA检测细胞IL-1β、HMGB1和TNF-α的表达

细胞因子（IL-1β、HMGB1和TNF-α）水平检测：按照3×106个/皿将HL-1细胞接种在6孔板中，给予药物后孵育1h，加入1mg·L-1LPS，24h后收集细胞上清液，并检测细胞蛋白浓度。96孔ELISA板包被细胞因子的捕获抗体，4 ℃过夜。次日，运用含0.1‰吐温20的磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤3次，吸水纸拍干剩余液体，用BSA封闭含有抗体的ELISA板1 h，加入细胞培养上清液，室温孵育2h。2h后运用PBST洗涤3次，加入细胞因子的检测抗体，室温孵育1 h。1 h后运用PBST洗涤3次，加入Strapavaidin-HRP，室温孵育30 min。随后加入HRP显色底物（TMB）室温避光孵育15 min。15 min后加入终止缓冲液（4%H2SO4），运用酶标检测仪于450 nm处检测吸光度。

2.7 Western blot检测细胞Caspase1、GSDMDN端和NLRP3的表达

细胞裂解后，测定蛋白浓度并配平每个蛋白的上样量。等量蛋白通过SDS胶进行分级分离，然后湿法转移至PVDF膜上，分子量小的用0.2 μm孔径的膜，分子量大的用0.45 μm孔径的膜。90 min后用5%脱脂牛奶进行封闭，待封闭好后加入一抗（抗Caspase1兔多克隆抗体、抗GSDMD兔多克隆抗体、抗NLRP3兔多克隆抗体和抗Tubulin兔单克隆抗体，稀释均为1∶1000），置室温摇床孵育2 h后移至4 ℃摇床过夜。次日加入HRP结合的二抗（1∶3000），二抗孵育1 h后用TBST洗涤3次。加ECL液避光孵育2 min，用曝光仪成像。

2.8 siRNA诱导的基因沉默

利用特异性siRNA序列实现细胞内的基因沉默。采用Lipofectamine 2000将10 nmol·L-1的siRNA转染至HL-1细胞，具体操作根据说明书指示进行。

2.9 统计学处理

采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用Student’s t检验，多组间比较采用单因素方差分析并以Bonferroni校正。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 低剂量的SchC不影响HL-1细胞增殖

MTT法检测各浓度对HL-1细胞增殖的影响。结果显示，100 μmol·L-1及以上浓度的SchC可明显抑制HL-1细胞增殖（P<0.01），见图1。表明高浓度SchC对HL-1细胞有着细胞毒性作用，可能会影响后续实验，故只使用5、10、20 μmol·L-1浓度的SchC。

3.2 SchC剂量依赖性抑制LPS引起的HL-1细胞活力

MTT实验结果显示，在LPS（1 mg·L-1）处理24 h或48 h条件下，与对照组相比，LPS组HL-1细胞活力明显下降（P＜0.01），而SchC可剂量依赖性改善LPS诱导的HL-1细胞活力下降，见图2A～B。表明SchC可缓解LPS诱导的HL-1细胞活力下降。

3.3 SchC抑制LPS诱导的细胞焦亡

不同浓度SchC（5、10、20 μmol·L-1）预先处理HL-1细胞1 h后，LPS（1 mg·L-1）刺激细胞24 h后收集细胞培养基上清液检测炎症细胞因子IL-1β、HMGB1、TNF-α 的分泌水平。结果显示，与对照组相比，LPS可上调IL-1β、HMGB1和TNF-α 的分泌水平，经SchC处理后，HL-1细胞的IL-1β、HMGB1、TNF-α 的分泌水平降低，且SchC浓度越大，其抑制效果越佳，见图3A～C。

不同浓度SchC（5、10、20 μmol·L-1）预先处理HL-1细胞1 h后，LPS（1 mg·L-1）刺激细胞24 h后收集细胞、检测活化的炎性半胱天冬酶（cleaved-Caspase1）和GSDMD-N端的蛋白表达。实验结果显示，与对照组相比，LPS可上调cleaved-Caspase1、GSDMD-N端和NLRP3的蛋白表达，经SchC处理后，HL-1细胞的cleaved-Caspase1、GSDMD-N端和NLRP3的蛋白表达呈剂量依赖性降低，见图4A～D。表明SchC可降低LPS诱导的细胞焦亡。

3.4 SchC通过减少细胞焦亡缓解LPS引起的HL-1细胞活力下降

后续为确证SchC通过减少细胞焦亡缓解LPS引起的细胞活力下降。利用siRNA沉默HL-1细胞的GSDMD的表达后，SchC预处理1 h，再用LPS处理24 h，结果发现沉默GSDMD后，LPS引起HL-1细胞的IL-1β 水平有明显降低，但SchC预处理组与siGSDMD＋LPS组相比并无统计学差异，见图5 A～B；MTT实验结果显示，沉默GSDMD后，LPS引起的HL-1细胞活力有明显上升，但SchC预处理组与siGSDMD＋LPS组相比并无统计学差异，见图5C。表明SchC可能通过减少细胞焦亡缓解LPS引起的细胞损伤。

4 讨论

现已证明，内毒素在机体的脓毒性反应中起着触发剂的作用，在激活的连锁反应中，细胞因子可能起核心作用[7]。研究报道，LPS引起小鼠心脏炎症反应及细胞凋亡与焦亡，从而导致小鼠心功能异常[3，8]。近年来，研究发现细胞焦亡与感染性疾病、自发炎症性疾病和自身免疫性疾病等密切相关[9-11]。在细胞焦亡发生初期，通过识别LPS等细胞外感染源，激活NF-κB信号通路，促进炎症小体NLRP3活化以及pro-Caspase家族蛋白、pro-IL-1β 和pro-IL-18的转录合成，而后依赖Caspase家族蛋白剪切上述蛋白前体与执行蛋白GSDMD，从而激活细胞焦亡。其中GSDMD在细胞焦亡过程中起着执行者的角色，测定炎性半胱天冬酶（Caspase）通过剪切GSDMD形成含有GSDMD-N端活性域的肽段，以及IL-1β 和IL-18等细胞因子的水平，可以从一定程度反应机体的焦亡过程和炎症水平。目前应用于临床的治疗脓毒症心肌损伤的药物很少，由细胞焦亡在脓毒症诱发心肌损伤的重要性出发，对寻找新的治疗药物有着重要意义。

五味子丙素（SchC）是五味子的一种二苯并环辛二烯衍生物，被证明能够缓解脂磷壁酸刺激小胶质细胞和痤疮丙酸杆菌、引起巨噬细胞的细胞炎症[7，8]。本研究发现，通过LPS诱导小鼠心肌细胞24 h后，炎症因子IL-1β、TNF-α、HMGB-1的分泌水平显著升高。当给予SchC预处理心肌细胞1 h后发现，炎症因子IL-1β、TNF-α、HMGB-1的分泌水平明显降低，这说明SchC是通过抑制炎症因子的分泌、缓解LPS诱导过程心肌损伤。由Western Blot实验显示，LPS刺激小鼠心肌细胞24 h后，Cleaved-Caspase1、GSDMD-N端、NLRP3的蛋白水平显著升高，SchC预处理LPS刺激的小鼠心肌细胞1h后，Cleaved-Caspase1、GSDMD-N端、NLRP3的蛋白水平呈剂量依赖性降低。这预示着SchC的抗细胞损伤活性可能是由于降低了细胞焦亡的激活。为进一步验证这一设想，后续实验采用GSDMD的siRNA沉默心肌细胞的GSDMD表达，继而用SchC处理细胞后LPS刺激细胞24 h，结果显示，SchC在GSDMD缺失的情况下，无法发挥其抗炎和抗细胞损伤作用，表明SchC对LPS诱导的炎症反应和细胞损伤的缓解作用源自其对细胞焦亡的抑制活性。

综上所述，本研究表明，SchC能有效抑制LPS诱导的心肌细胞焦亡的激活而缓解心肌细胞损伤，这可能是一个有效治疗脓毒症心肌损伤和缓解心功能异常的有效单体成分。