高效液相－蒸发光散射法测定芪归益母膏中黄芪甲苷含量

熊有明，崔 虹，熊学庆

（1. 重庆市万州食品药品检验所，重庆 404000； 2. 重庆市万州区中医院，重庆 404000）

芪归益母膏是重庆市万州区中医院研制的医院制剂，由黄芪、当归、益母草、白芍4 味中药组方，具有益气养血、调经止痛作用，主要用于治疗月经不调及痛经等症。黄芪为方中君药，味甘，性微温，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、托毒排脓、敛疮生肌的功效。皂苷类是黄芪的主要活性成分，以黄芪甲苷为代表，为黄芪药材的质量控制指标[1]，具有降压消炎、镇静镇痛作用，能影响血清和肝脏蛋白质合成。该制剂现行质量标准只有鉴别和通则检查项，不能有效控制其质量。为提高芪归益母膏质量的可控性和稳定性，保证临床用药安全，本研究中参照2015年版《中国药典（一部）》及文献[1－6]，采用高效液相－蒸发光散射（HPLC－ELSD）法测定芪归益母膏中黄芪甲苷的含量，为该制剂的质量控制提供定量检测方法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC－20A 型高效液相色谱仪（日本岛津公司），包括LC－20AT 型输液泵，ELSD－LTⅡ型蒸发光散射检测器，CTO －20A 型柱温箱，SIL －20A 型自动进样器，LCsolution 色谱工作站；XP204 型电子天平（瑞士梅特勒－托利多公司，精度为0.1 mg）；ME215S 型电子天平（德国赛多利斯集团，精度为0.01 mg）。

1.2 试药

黄芪甲苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110781－201314，含量为95.8%）；芪归益母膏（重庆市万州区中医院供，批号分别为20190605，20190829，20191029）；D101 型大孔吸附树脂，正丁醇、氨水、乙醇均为分析纯，均购自成都科龙化工试剂厂；乙腈（色谱纯，德国Merck 公司）；水为纯化水（自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[2 －6]与系统适用性试验

色谱柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈－水（33 ∶67，V／ V）；流速：1.0 mL／min；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；蒸发光散射检测器（ELSD）参数：氮气压力为325 kPa，漂移管温度为40 ℃，增益为6。分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，按拟订色谱条件测定，色谱图见图1。黄芪甲苷峰理论板数不低于5 000，分离度均大于1.5。可见，阴性对照品对黄芪甲苷的测定无干扰，且黄芪甲苷和其他组分可达到基线分离。

2.2 溶液制备

对照品溶液：取黄芪甲苷对照品10.27 mg，精密称定，置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密吸取对照品贮备液3.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

图1 高效液相色谱图

供试品溶液[1]：取本品2 g，精密称定，置250 mL 分液漏斗中，加20 mL 水溶解，用水饱和正丁醇提取5 次，每次20 mL，合并正丁醇，用正丁醇饱和的氨试液洗涤2 次，每次40 mL，再用正丁醇饱和的水洗涤2 次，每次40 mL，蒸干，残渣加水5 mL 使溶解，放冷，通过D101 型大孔吸附树脂（内径为1.2 cm，柱高为10 cm），以水30 mL洗脱，弃去水液，再用70%乙醇100 mL 洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

阴性对照品溶液：按处方（不含黄芪）及本品工艺制备阴性样品，按供试品溶液项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

线性关系考察：精密量取黄芪甲苷对照品贮备液0.6，1.5，3.0，4.0，6.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为11.81，29.52，59.03，78.71，118.06 mg／L 的系列对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，按拟订色谱条件进样测定，以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y＝1.440 5X＋6.101 1，r＝0.999 9（n＝5）。结果表明，黄芪甲苷进样量在0.236 ～2.362 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取对照品溶液（质量浓度为59.03 mg／L）20 μL，重复进样6 次，记录峰面积。结果的RSD为0.89%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批（批号为20190605）样品，依法制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12，24 h 时进样测定。结果黄芪甲苷峰面积的RSD为0.25% （n＝7），表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

重复性试验：取同一批（批号为20190605）样品，依法制备供试品溶液，平行6 份，分别进样测定，计算黄芪甲苷的含量。结果平均含量为0.210 mg／g，RSD为0.82%（n＝6），表明该方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品9 份，精密称定，每份1 g，置250 mL 分液漏斗中，以3 份为1 组，每组分别精密加入黄芪甲苷对照品贮备液0.5，1.0，1.5 mL，依法制备供试品溶液，计算加样回收率。结果见表1。

表1 黄芪甲苷回收加样试验结果（n ＝9）

2.4 样品含量测定

取3 批样品，依法制备供试品溶液，各精密吸取20 μL，按拟订色谱条件进样测定。结果批号为20190605，20190829，20191029 的样品中黄芩甲苷平均含量分别为0.220，0.210，0.200 mg／g。

3 讨论

3.1 检测器选择

黄芪甲苷在紫外区只有吸收度很小的末端吸收，灵敏度很差，故参照2015年版《中国药典（一部）》方法（蒸发光散射检测法）对芪归益母草膏中黄芪甲苷的含量进行测定。

3.2 供试品提取

供试品经水饱和正丁醇提取后，考察了水洗（正丁醇饱和的水）和碱洗（正丁醇饱和的氨试液）对含量测定的影响。结果表明，碱洗含量明显高于水洗，故选择碱洗。

3.3 流动相选择

考察了甲醇－水，乙腈－水不同体系流动相，结果发现以乙腈－水为流动相时，黄芪甲苷响应度强，峰形好，优化条件后，确定乙腈－水（33 ∶67，V／ V）为流动相。

3.4 方法评价

采用HPLC－ELSD 法测定芪归益母膏中黄芪甲苷的含量，受主客观因素的干扰较小，准确、简便，重复性好，可作为芪归益母膏的定量分析方法。该医院制剂临床应用广泛，药效良好。本研究中采用的HPLC－ELSD法快速、准确、操作简便、检测限低，可用于芪归益母膏中黄芪甲苷的含量测定。建议将黄芪甲苷含量测定列入质量控制指标，以更好地控制该制剂的质量。