铁丝威灵仙质量标准研究

杨宇慧，段超慧，王 皓，段 羚，张 婷，杨桂娥

（内蒙古自治区包头市食品药品检验检测中心，内蒙古 包头 014060）

铁丝威灵仙为百合科植物短梗菝葜Smilax scobini-caulisC.H.Wright、华东菝葜Smilax sieboldii Miq的干燥根及根茎。短梗菝葜主产于河北、山西、河南等地，华东菝葜主产于辽宁、山东、江苏等地[1－5]，具有祛风、除湿、散瘀、解毒等功效，主要用于治疗风湿腰腿痛、疮疖等症。该品种收载于1988年版《内蒙古中药材标准》，仅对其性状及显微特征进行了规定，而其薄层色谱鉴别[6]、水分、杂质、总灰分、酸不溶性灰分的测定及含量测定未作规定。完善质量标准项目与药物的临床疗效、稳定性和安全性密切相关，本研究中在铁丝威灵仙原有质量标准基础上，对薄层色谱鉴别、水分、灰分、含量测定等项目进行了较系统和全面的分析，为建立其质量标准体系提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Sartorius BP－211D 型电子天平（精度为0.01 mg）、Sartorius BS300S－WEI 型电子天平（精度为0.1 mg）均购自北京赛多利斯仪器系统有限公司；Mettler Toledo ME104E 型电子分析天平（瑞士梅特勒－托利多公司，精度为0.000 1 g）；Leica DM3000B 型智能显微镜（德国莱卡仪器有限公司）；Aglient 1260 型高效液相色谱仪（美国Aglient 公司）；KQ －700DE 型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为300 W，频率为4.0 kHz）；HH－4 型数显恒温水浴锅（金坛市白塔金昌实验仪器厂）。

1.2 试药

短梗菝葜（编号为S1 ～S7），其中S6 和S7 号样品为本项目组自行采集，并经河南信阳师范学院植物学教研室朱鑫鑫讲师鉴定为百合科植物短梗菝葜正品，其他批次样品经本中心实验室通过性状、显微、薄层色谱、有效成分含量测定等方式比对，确定均为百合科植物短梗菝葜正品，于大连长山岛和大黑山采集华东菝葜2 批（编号为S8 ～S9），样品信息见表1；薯蓣皂苷元对照品（批号为111539－200001），白藜芦醇对照品（批号为111535－201703，纯度为99.4%），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（HPLC Grade，LOT 178509，Fisher Chemical）；其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

表1 样品基本信息

2 方法与结果

2.1 性状鉴别

短梗菝葜：本品根茎呈不规则块状，略横向延长而弯曲，有针状小刺，下侧着生许多细长的根。根长20 ～100 cm，直径1 ～2 mm，表面灰褐色或灰棕色，平滑，带有细小钩状刺及少数须根。质韧，不易折断，富有弹性，断面外圈为浅棕色环（石细胞），内有一圈排列均匀的小孔（导管）。气无，味淡。详见图1 A。

华东菝葜：根茎及根外形同短梗菝葜极相似，稍有不同处在于根粗细均匀，刺相对较少。详见图1 B。

图1 短梗菝葜根及根茎

2.2 显微鉴别

采用2015年版《中国药典（四部）》通则2001 项下显微鉴别法鉴别各批次样品横切面及粉末显微特征。

不定根的横切面（直径约1.5 mm）：内皮层外侧的组织多已脱落，有时可见残存皮层细胞。内皮层有1 列由棕色色素的石细胞组成，细胞内壁及侧壁三面显著增厚，胞腔小，有明显的层纹及孔沟，中柱具初生结构，约占根的1／2。中柱鞘为9 ～13 层木化厚壁纤维，直径17 ～40 μm，韧皮部由薄壁细胞和筛管组成，与木质部相间排列，各15 ～25 个，呈辐射状。木质部由导管和木纤维组成。详见图2。

图2 不定根横切面（×100）

粉末显微特征：取一定量样品，粉碎，过4 号筛，采用水合氯醛透化法观察粉末特征。本品粉末污黄色。髓细胞长方形，壁厚化，直径18 ～76 μm，多数细胞可见有圆形或长形细小单纹孔。中柱鞘纤维直径17 ～40 μm，壁较厚，木化。纤维单个散在，黄色或白色；一种黄棕色，次生壁极度增厚，纹孔沟分枝状汇合；另一种次生壁略微增厚，白色孔沟明显，胞腔较小。有梯纹和具缘纹孔导管，梯纹导管直径20 ～160 μm，具缘纹孔导管较少见。石细胞呈类圆形、类方形或长方形，直径约70 μm，胞腔狭细，两侧胞壁增厚，具显著孔沟。淀粉粒单粒或2 ～8 个分粒组成的复粒，单粒呈圆形或卵圆形，脐点点状，具层纹，但不明显。详见图3。

2.3 薄层色谱鉴别（薯蓣皂苷元）

取9 批样品粉末5 g，精密称定，加入无水乙醇50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液加36.5%盐酸5 mL，加热回流2 h，放冷，用40%氢氧化钠溶液调至中性，挥干至无醇味，残渣加热水40 mL 使溶解，用二氯甲烷振摇提取2 次（40 mL，30 mL），合并提取液，挥干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成质量浓度为0.5 mg／mL 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（2015年版《中国药典》通则0502）试验，分别吸取上述溶液各5 μL，点于同一硅胶G 薄层板上。以环己烷－乙酸乙酯（4 ∶1，V／ V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点。色谱图见图4。

图3 粉末显微特征（×400）

图4 铁丝威灵仙中薯蓣皂苷元薄层色谱图

2.4 检查

按内蒙古自治区中蒙药材和炮制品标准修订工作手册的技术要求，对本品进行了水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物的考察。测定结果见表2。

表2 水分、灰分、酸不溶性灰分及浸出物测定结果（%）

2.5 白藜芦醇含量测定[7 －9]

2.5.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agela Venusil MP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Agilient Zorbax Elipse XDB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈－水（27 ∶73，V／ V）；检测波长：308 nm；流速：1.0 mL／min；柱温：30 ℃。理论板数按白藜芦醇峰计应不低于8 000。色谱图见图5。

图5 高效液相色谱图

2.5.2 溶液制备

取白藜芦醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含27 μg 的溶液，即得对照品溶液。取本品粉末（过4 号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇15 mL，密塞，超声处理30 min，转移上清液，滤过，残渣加15 mL 甲醇超声提取30 min，过滤残渣及二次提取液，并用甲醇洗涤残渣3 次，每次10 mL，合并所有滤液，水浴蒸至10 mL 以下，冷却，用甲醇定容至25 mL容量瓶，摇匀，即得供试品溶液。取白藜芦醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为1 mg／mL 的溶液（实际配制质量浓度为1.080 0 mg／mL），作为对照品贮备液。

2.5.3 方法学考察

线性关系考察：精密量取对照品贮备液，配制成质量浓度为5.4，10.8，27.0，54.0，64.8，81.0 μg／mL 的系列标准溶液，按拟订色谱条件进样测定，以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y＝31.089 62X＋5.413 56，R2＝0.999（n＝6）。结果表明，白藜芦醇质量浓度在5.4 ～81.0 μg／mL 范围内与峰面积线性关系良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液（编号S3），常温下分别于0，2，4，6，8，10，12 h 时按拟订色谱条件进样5 μL。结果白藜芦醇峰面积的RSD为0.74 %（n＝7），表明供试品溶液在常温下12 h 内稳定。

重复性试验：取同一供试品（编号S3）6 份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，按外标法计算含量。结果的RSD为1.24 % （n＝6），表明该方法重复性良好。

精密度试验：精密吸取供试品溶液（编号S2）5 μL，按拟订色谱条件连续进样6 次。结果白藜芦醇峰面积的RSD为0.16%（n＝6），表明仪器精密度良好。

加样回收试验：取已知白藜芦醇含量（0.057%）的样品（编号S2）粉末3 份，精密称定，分别按已知量的80%，90%，110%加入白藜芦醇对照品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，按外标法计算含量。结果见表3。

表3 白藜芦醇加样回收试验结果（n ＝9）

方法检测限（LOD）及定量限（LOQ）确定：依据逐级降低浓度进样法，测得白藜芦醇的仪器检出质量浓度为0.302 4 ng／mL，参考GB／T27417－2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》，采用添加标准物质的方法获得方法检测限为0.26 μg／g。为增加数据可信性，采用10 倍检出限来表示定量限，故定量限为2.6 μg／g。

耐用性试验：采用不同厂家、不同型号色谱柱，取样品（编号S4），精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，按外标计算含量。结果的RSD为0。

2.5.4 样品含量测定

按2.5.2 项下方法制备供试品溶液，测定含量，结果见表4。可见，9 批样品白藜芦醇含量的平均值为0.06%。考虑到药材质量差异，以9 批中平均值下浮20%确定含量限度，即0.06 % ×（1－20%）＝0.048 %，故暂定本品含白藜芦醇（C14H12O3）不得少于0.05%。

表4 样品中白藜芦醇含量测定结果

3 讨论

本研究中对铁丝威灵仙的质量进行了系统分析，总灰分及酸不溶性灰分数据相差较大，可能因为铁丝威灵仙为根及根茎入药，若采集后对其净制不规范则可能带入较多泥土杂质，而我中心自行采集并净制处理的样品灰分值较低。可见，除其生长环境因素外，规范的净制可有效降低样品中混入的泥沙等杂质。

薯蓣皂苷元薄层色谱鉴别中，充分考察提取条件、展开条件及点样量对斑点的影响。经验证，提取样品与薯蓣皂苷元对照品在相同位置显相同的荧光斑点，且主斑点清晰，其他斑点分离良好，无干扰，说明该提取条件与展开条件适用于薯蓣皂苷元的薄层鉴别。

白藜芦醇具有抗肿瘤、抗氧化、抗自由基、保护肝脏、保护心血管等功能，成为较受瞩目的绿色抗癌药物；此外，还具有调节免疫、抗病毒、抗菌、抗变态反应、辐射防护等药用价值[10－14]。本研究中对铁丝威灵仙药材进行定性定量分析，发现样品中白藜芦醇含量差异较大，有必要对其质量进行控制，且2015年版《中国药典（四部）》中并无白藜芦醇的含量测定方法。因此，本研究中选择白藜芦醇作为定量测定成分，方法简单，准确可靠，样品的收集具有一定代表性，在此基础上可制订铁丝威灵仙药材的质量标准。