双黄连片高效液相色谱指纹图谱的建立及聚类分析和主成分分析

唐佩琴

（中国人民解放军联勤保障部队第九○○医院药学科，福建 福州 350000）

双黄连片由连翘、黄芩、金银花3 味药材按2 ∶1 ∶1的处方配比制备而得，具有疏风解表、清热解毒之功效，临床用于治疗外感风热所致感冒[1]，收载于2015年版《中国药典（一部）》。现行质量标准分别采用3 种不同的色谱条件和不同的样品前处理来检测黄芩苷、绿原酸及连翘苷3 种成分的含量，操作烦琐。目前，已有关于双黄连制剂包括口服液、颗粒剂、粉针剂等剂型的质量控制分析[2－4]，但鲜有双黄连片的多成分质量控制。中药制剂是多种药材的内在多活性成分多靶点协同起效，仅对单一成分定量分析并不能准确判断其质量和疗效。中药指纹图谱可系统、科学、全面、综合地反映中药复方制剂的整体性，是一种半定量鉴别技术，强调对图谱共有峰归属的辨识和图谱相似性评价，已成为国际认可化的质量评价模式，广泛应用于中药产品质量一致性和稳定性评价。主成分分析法是将指纹图谱中的多指标信息转换成综合指标，达到简化综合分析的目的[5－7]。本研究中共收集了2 个不同生产厂家12 批次双黄连片，建立了高效液相色谱指纹图谱，共确定18 个共有峰，并采用聚类分析及主成分分析法考察双黄连片的质量特征，确定引起质量差异的特征色谱峰，为系统评价双黄连片的质量提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：Agilent 1260 型高效液相色谱仪，包括G1311A 四元梯度泵、G1329A 自动进样器、G1314BDAD 检测器、G1316A 柱温箱、Agilent－Chemistation 数据处理系统（安捷伦科技有限公司）；AUW－220D 型电子天平（美国岛津公司，精度为0.01 mg）；KQ－250DB型数控超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司，功率为500 W，频率为50 kHz）；Milli－QAcademic 型超线水系统（默克密理博公司）。

试药：双黄连片（编号S1 ～S5，哈尔滨圣泰生物制药有限公司，批号分别为20180611，20180907，20181105，20181211，20190122；编号S6 ～S12，药都制药集团股份 有限公司，批号分别为190103，190212，190317，190425，190521，190602，190705）；绿原酸对照品（批号为110753－201817，含量为96.8%），木犀草苷对照组（批号为111720－201609，含量为94.9%），连翘酯苷A对照品（批号为111810－201707，含量为97.2），连翘苷对照品（批号为110821－201816，含量为95.1%），黄芩苷对照品（批号为110715－201821，含量为95.4%），汉黄芩苷对照品（批号为112002－201702，含量为98.5%），黄芩素对照品（批号为111595－201607，含量为98.5%），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（批号为AS184407），甲醇（批号为MS1923814）均为色谱纯，均购自美国Merck 公司，甲酸（分析纯，批号为20190517，西陇科学股份有限公司）；水为超纯水。

2 方法与结果[8 －10]

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）－0.07%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0 ～12 min 时8% →16%A，12 ～20 min 时16% →25%A，20 ～26 min 时25% →30%A，26 ～33 min 时30%→35%A，33 ～42 min 时35%→55%A，42 ～46 min时55%A，46 ～68 min 时55%→75%A）；分段切换波长：320 nm（0 ～32 min，绿原酸和木犀草苷），220 nm（32 ～46 min，连翘酯苷A 和连翘苷），275 nm（46 ～68 min，黄芩苷、汉黄芩苷及黄芩素）；流速：0.9 mL／min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；色谱记录时间：68 min。

2.2 溶液制备

取绿原酸、木犀草苷、连翘酯苷A、连翘苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷对照品各适量，精密称定，用60%甲醇溶液溶解并配制成每1 mL 含绿原酸0.037 5 mg、木犀草苷0.087 9 mg、连翘酯苷A 0.288 5 mg、连翘苷0.143 6 mg、黄芩苷0.134 7 mg、汉黄芩苷0.108 2 mg、黄芩素0.066 4 mg 的混合对照品溶液，避光、冰箱冷藏保存，备用。取样品20 片，研细，取约1.0 g，精密称定，置50 mL 棕色容量瓶中，加入60%甲醇溶液35 mL，恒温超声处理（功率为450 W，频率为40 kHz）45 min，取出，放冷，加60%甲醇溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

精密度试验：取同一混合对照品溶液，按拟订色谱条件连续进样6 针（每针10 μL），记录指纹图谱，以连翘酯苷A 为参比峰。结果各共有峰相对保留时间的RSD＜1.2%（n ＝6），相对峰面积的RSD＜2.2%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批（批号为20181211）样品，依法制备供试品溶液，在室温放置0，3，6，9，12，18，24 h时按拟订色谱条件进样分析，记录指纹图谱，以连翘酯苷A 峰为参比峰。结果各共有峰相对保留时间的RSD＜1.8%（n ＝6），相对峰面积的RSD＜2.0% （n＝6），表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

重复性试验：取同一批（批号为20181211）样品，依法制备供试品6 份，研细，过筛（80 目），取细粉，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录指纹图谱，以连翘酯苷A 为参比峰。结果各共有峰相对保留时间的RSD＜1.3%，相对峰面积的RSD＜2.5% （n＝6），表明方法重复性良好。

2.4 高效液相色谱指纹图谱的建立

取样品（编号S1 ～S12），研细，过80 目筛，取细粉，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，采用2012年版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》以下简称《评价系统》对12 份指纹图谱进行分析。结果见图1。

2.5 相似度评价分析

采用《评价系统》，以供试品高效液相色谱指纹图谱为参照，进行整体相似度评价。结果来自2 个厂家的12批供试品溶液的指纹图谱相似度为0.913 ～0.984，表明各批次间各成分含量存在差异。结果见表1。

2.6 共有峰指认

12 批供试品溶液高效液相色谱指纹图谱中共确定18 个共有峰，与图1 C 比对，指认出7 个成分，8 号峰为绿原酸、12 号峰为木犀草苷、13 号峰为连翘酯苷A、14号峰为连翘苷、16 号峰为黄芩苷、17 号峰为汉黄芩苷和18 号峰为黄芩素。比对色谱峰相对保留时间和分离度等因素，发现保留时间34.22 min 处的13 号峰位置适中，与前后色谱峰分离完全，且信号强度最大，故选择13 号峰（连翘酯苷A）为参照，计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积及其RSD。结果见表2。

2.7 聚类分析[11 －12]

将12 批样品18 个共有峰的相对峰面积数据导入SPSS 22.0 统计学软件，采用离差平方和法（Ward 法），以欧氏距离平方（SED）为测度，采用系统聚类分析法进行模式识别分析。结果见图2。根据聚类分析树状图，类间距离为5 时，12 批样品被分成了两大类：样品S1 ～S5与对照指纹图谱相似度小于0.94，样品S6 ～S12 与对照指纹图谱相似度大于0.95。可见，聚类分析结果与相似度结果基本一致，同一厂家聚为一类，不同厂家的产品所含成分存在差异，而同一厂家各成分含量均匀、稳定，可能与厂家药材来源、采收和生产加工工艺有关。

图1 高效液相色谱指纹图谱

表1 12 批双黄连片样品相似度评价结果

表2 12批样品高效液相色谱指纹图谱共有峰的相对保留时间和相对峰面积

图2 12 批样品聚类分析树状图

2.8 主成分分析[13 －14]

以指纹图谱中18 个共有峰的峰面积为变量，构建19×18 的原始数据矩阵，采用SPSS 22.0 统计学软件对12 批样品主成分进行分析。结果见表3 和表4。可见，提取的2 个主成分特征值均大于1，且累计方差贡献率达92.242%，2 个主成分足以解释18 个共有峰的主要特征和信息。主成分1 主要反映绿原酸、木犀草苷、连翘酯苷A、连翘苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷的信息，峰9、峰11、峰15 对主成分2 贡献率较大。

表3 2 个主成分的特征值及方差贡献率

表4 初始因子载荷矩阵

3 讨论

3.1 测定目标成分选择

双黄连片处方中连翘、金银花和黄芩的用量比为2 ∶1 ∶1，连翘具有抗菌、强心、利尿等药理作用，主要含有连翘酯苷、连翘苷、齐墩果酸及挥发油等成分。其中，连翘脂苷是连翘中最主要的抗菌活性成分[15]，也是双黄连片主要的质控指标成分之一。黄芩具有泻火、除湿热的功效，是凉血解毒、清热燥湿的要药，故选取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素等黄酮类化合物作为制剂中黄芩药材的质控指标[16]。金银花具有抑菌、抗病毒、抗炎、解热作用，特征成分绿原酸和木犀草苷在高效液相色谱图中可清晰分辨[17]。

3.2 色谱条件选择

采用DAD 检测器在190 ～400 nm 波长紫外光区对对照品溶液进行了全波长扫描；考察了乙腈－水、甲醇－水、乙腈－磷酸水、甲醇－磷酸水、乙腈－甲酸溶液、甲醇－甲酸溶液流动相系统不同梯度洗脱条件；对Shimadzu VP－ODS 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent Zorbax－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱进行了优选；筛选0.6，0.8，0.9，1.0，1.2 mL ／ min 的流速，以及柱温25，30，35 ℃。最终按拟订色谱条件进样，各色谱峰信息最多，各成分分离情况良好，可用于双黄连片的指纹图谱分析。

本研究中建立的双黄连片高效液相色谱指纹图谱，提取到18 个共有峰，以13 号峰（连翘酯苷A）为参照峰，计算其他各共有峰的相对峰面积，并进行了聚类分析和主成分分析。利用降维思想，将较多原始变量综合成较少变量的主成分分析，能系统、客观地反映出其内在质量信息及引起不同批次双黄连片差异的主要原因，方法简便、实用，可作为评价双黄连片质量的参考依据。