侗药马卡列丙化学成分预试验及总多糖含量测定*

谭紫玲，王李婷，智馨君，王向根，江仁峰，刘良红，2△

（1. 湖南医药学院药学院，湖南 怀化 418000； 2. 侗医药研究湖南省重点实验室，湖南 怀化 418000）

马卡列丙（侗药名）Duhaldea nervosa（Wallich ex Candolle）A.Anderberg（D.nervosa）又名毛秀才（湖南）、小黑药（云南）、草威灵（贵州）等[1]，是菊科羊耳菊属植物显脉旋覆花[2]的全草，主要分布在四川西部和西南部、云南北部至南部、贵州西部至北部和广西西部的山地杂木林下、草坡和湿润草地，在越南、缅甸、泰国、印度、不丹、锡金、尼泊尔亦有分布[2]，具有祛风除湿、活络止痛、健胃消食之功效，主要用于治疗风湿疼痛、腰膝酸软、跌打损伤和骨折，可显著缩短骨折病程，是侗族人民常用的跌打损伤特效药[3－4]。目前，关于马卡列丙的研究主要集中于生物学特性和少量的弱极性化学成分（如萜类、甾体类和挥发油类成分[5－9]），但对其极性成分研究较少，仅有本课题组关于绿原酸类成分定性和定量的研究[10－11]。化学成分预试验表明，马卡列丙含有大量多糖，多糖是来自高等植物、动物细胞膜、微生物细胞中的天然大分子物质，是自然界含量最丰富的生物聚合物[12－13]，是维持生命活动正常运转的基本物质之一。多糖能减轻关节肿胀，抑制关节疼痛、滑膜增生、炎症，降低骨内压，清除氧自由基，改善局部微循环等作用[14－16]。本研究中首次采用系统预试验法对马卡列丙的化学成分进行较全面的检测，明确了其可能的化学成分，尤其是极性成分的种类，并测定了其总多糖含量，为研究其活性成分的提取及化学成分与药理活性间的关系提供试验基础。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：HH 型恒温水浴锅（江苏金坛市中大仪器厂）；ZF－1 型三用紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）；LC－350A 型超声提取仪（山东济宁鲁超超声设备有限公司）；PTX－FA210 型电子分析天平（上海实润实业有限公司）。

试药：马卡列丙的干燥根及根茎，于2017年5月采购自云南，经湖南医药学院汪冶教授鉴定为正品，药材粉碎，过4 号筛，得粗粉。纯化水（自制）；乙醇（批号为20180406）、甲醇（批号为20180906），正丁醇（批号为20180116）、盐酸（批号为20180102），醋酐（批号为20140416），浓硫酸（批号为20180310），均购自成都金山化学试剂有限公司；氢氧化钠（西陇科学股份有限公司，批号为190103），茚三酮（批号为20170924），硅钨酸试剂（批号为20180425），盐酸羟胺（批号为20180822），碳酸钙（批号为20170813），氯化钠（批号为20181206），溴酚蓝（批号为20170617），均购自国药集团化学试剂有限公司；明胶（批号为20160619），镁粉（批号为20170127），三氯化铝（批号为20171226），三氯化铁（批号为20170624），硼酸（批号为20180120），香草醛（批号为200509015），均购自天津市科密欧化学试剂有限公司；氯仿（天津市富宇精细化工有限公司，批号为20170425）；碘化铋钾（天津市光复精细化工研究所，批号为20171110）；高锰酸钾（广东省化学试剂工程技术研究开发中心，批号为20120624）；3，5－二硝基苯甲酸试剂（上海试剂三厂，批号为811123）；苯酚（天津市永大试剂有限公司，批号为20190119）；D－（＋）－Glucose（Stanford Chemicals，批号为TC170820）。

2 方法与结果

2.1 化学成分预试验

2.1.1 供试液制备[17]

水供试液：取粗粉10 g，精密称定，浸于100 mL 蒸馏水中，超声1 h，滤过，取10 mL 滤液，作为冷水提取液，用于氨基酸、多肽和蛋白质的检测；余液和残渣在60 ℃水浴中加热1 h，滤过，得热水提取液，用于糖、苷类、皂苷、酚类和鞣质、生物碱、黄酮类、有机酸和一般有机化合物等的检测。

乙醇供试液：取粗粉10 g，精密称定，浸于100 mL 95%乙醇中，超声1 h，滤过，可用于黄酮类、蒽酮类、酚类和鞣质、有机酸、香豆素和内酯类、强心苷、生物碱、三萜类和甾醇的检测。

石油醚供试液：取粗粉10 g，精密称定，加100 mL石油醚，并超声1 h，滤过得石油醚供试液，用于甾体、三萜类化合物、挥发油和油脂的检测。

2.1.2 预试验结果

采用试管试验法对上述马卡列丙水提取液、乙醇提取液和石油醚提取液进行化学成分检查，通过各种不同成分特有的颜色反应和沉淀反应，初步鉴定供试液可能含有的化学成分类型。结果见表1 至表3。根据预试验结果，若检查某类成分的结果呈阳性反应，则初步判断马卡列丙中含有某类成分；若为阴性反应，则判断不含某类成分。可见，马卡列丙含有多肽、蛋白质、还原糖、2，6－去氧糖、鞣质、有机酸、皂苷、黄酮、生物碱、蒽醌类、酚类、香豆素、内酯类、甾体和三萜、挥发油类等化学成分，其中还原糖、皂苷、生物碱、酚类化合物的反应明显，可能在马卡列丙中含量较高。

2.2 多糖含量测定

2.2.1 溶液制备

供试品溶液制备：取1 g 样品粉末，精密称定，加入80%乙醇100 mL，于90 ℃回流提取1 h，趁热过滤，滤渣连同滤纸置烧瓶中，加水100 mL，称定质量，于70 ℃回流提取2.5 h，称定质量，补液，趁热过滤，取续滤液1 mL置50 mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

表1 水供试液化学成分预试验结果

表2 乙醇供试液化学成分预试验结果

表3 石油醚供试液化学成分预试验

对照品溶液：取无水葡萄糖标准品0.005 01 g，精密称定，置10 mL 容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容，即得贮备液。分别吸取适量的贮备液，稀释定容，制成最终质量浓度为10，20，40，60，80，100 μg／mL 的对照品溶液。

2.2.2 检测波长选择

多糖在浓硫酸作用下水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚缩合成橙黄色化合物，通过紫外－可见分光光度法定量测得多糖类物质的含量[18]。在200 ～1 000 nm 波长范围内对马卡列丙多糖和葡萄糖进行全波长扫描。结果表明，马卡列丙多糖和葡萄糖均在491 nm 波长处有最大吸收。

2.2.3 方法学考察

线性关系考察：精密量取葡萄糖标准系列溶液各2.0 mL，分别置10 mL 带塞试管中，依次加入5%苯酚试剂1.0 mL，逐滴匀速加入浓硫酸溶液5 mL，置沸水浴中加热20min，冷却至室温，用紫外分光光度计在491nm 波长处测定其吸光度，并以无水葡萄糖质量浓度（C，g ／ L）为横坐标、吸光度值（A）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程A＝6.929 9C＋0.002 1，R2＝0.999 5（n＝6）。结果表明，经显色后的无水葡萄糖质量浓度在0.01 ～0.1 g／L范围内与吸光度线性关系良好。

精密度试验：精密量取对照品溶液2.0 mL，按拟订方法显色，测定吸光度，重复测定6 次。结果的RSD为0.15%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密量取同一供试品溶液2 mL，分别于0，2，4，6，8，10 h 时按拟订方法测定吸光度。结果的RSD为0.11%（n ＝6），表明供试品溶液在10 h 内稳定性良好。

重复性试验：准确称取样品各0.5 g，依法制备供试品溶液，按拟订方法测定吸光度。结果的RSD为1.8%（n ＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取供试品溶液1 mL，各6份，加对照品溶液1 mL，按拟订方法显色，测定吸光度，计算加样回收率。结果见表4。

表4 多糖加样回收试验结果（ n ＝6）

2.2.4 总多糖含量测定

按重复性试验项下方法测定总多糖含量。结果6 份样品中总多糖含量分别为32.75%，32.32%，33.76%，32.39%，32.17%，32.89%，平均32.71%。

3 讨论

本研究结果显示，马卡列丙可能含有多肽、蛋白质、还原糖、2，6－去氧糖、鞣质、有机酸、皂苷、生物碱、蒽醌类、酚类、香豆素、内酯类、甾体和三萜类等化学成分，其中还原糖、皂苷、生物碱、酚类化合物的反应明显，可能含量较高。通过取适量绿原酸类成分对照品与三氯化铁或铁氰化钾三氯化铁反应表明，酚类成分主要为绿原酸类成分，与本课题组前期报道[10]一致，而皂苷和生物碱类成分尚未见文献报道，在后续研究中可重点关注。

现代研究表明，多糖具有多种药理作用[19－20]，如抗病毒、抗癌、免疫调节、延缓衰老、抗辐射、降血糖、调血脂、美容等。总多糖的常用含量测定方法为苯酚－浓硫酸比色法[21－22]，简单易行，结果稳定，线性关系良好。本次马卡列丙预试验中，初步确定了其可能含有的化学组分，为其有效成分的提取、分离、纯化及药物开发研究提供了科学依据，为进一步开发利用提供了试验参考依据。