卵巢护养膏贮存期间的质量研究*

邬素珍，吴声振，吴向维

（广东省佛山市禅城区中心医院，广东 佛山 510530）

中药膏方因口感好、携带方便等优点[1]，逐渐成为人们养生保健的重要选择。中药膏方是中药的特有剂型，制作过程需经浸泡、煎煮、过滤、浓缩、收膏、凉膏、分装等复杂工序，需进行严格的质量控制，以保证制剂安全有效[2－5]。中药膏方制作过程不添加防腐剂，因其含水量低，渗透压高，可有效抑制微生物滋生，常温下可存放90 d 以上[6－8]，但其有效成分在贮存过程是否发生变化尚不明确。卵巢护养膏是由二仙汤加减组成，临床用于治疗肾虚证卵巢储备功能不全、骨质疏松症、老年性失眠等更年期症状[9－11]，需长期服用。为保证治疗期间膏方功效稳定，本研究中以微生物限度、相对密度、淫羊藿苷含量为指标，研究其贮存期间的质量变化，为膏方的服用期限提供试验依据。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：LC－20AT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司），BT25S 型电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司，精度为十万分之一）；微压中药煎煮机（北京东华原医疗设备有限公司）；KQ2200E 型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；GZX－9023 型电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；并联式中药膏方浓缩制备系统（自主研发，专利号为201620659405.0）。

试药：淫羊藿苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110737－201516）；水为重蒸水，其他试剂均为色谱纯；仙茅、淫羊藿、浮小麦、巴戟天等中药饮片，均购自广州至信药业股份有限公司，经佛山市食品药品检验检测中心钟然主任药师鉴定为正品；卵巢护养膏（医院制剂，批号分别为1080601，1080602，1080603）。

2 方法与结果

2.1 微生物限度检测

根据2015年版《中国药典（四部）》通则[12]中微生物计数法（通则1105）和控制菌检查法（通则1106）进行操作，于第0，10，20，30，60，90，120 天对3 批供试品进行抽样检定。结果供试品在120 d 内的细菌菌落计数均不超过10 cfu／mL（限度标准为≤100 cfu／mL），表明微生物限度符合规定，且均未检出大肠埃希菌和沙门菌，详见表1。

2.2 淫羊藿苷含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：AmethystC18－H 柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈－水（30 ∶70，V／ V）；检测波长：270 nm；流速：1.0 mL／min；进样量：10 μL。理论板数按淫羊藿苷峰计不低于1 500。

2.2.2 溶液制备

对照品溶液：取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，置容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得（质量浓度为360 μg／mL）。

供试品溶液：淫羊藿药材按处方调配后，加8 倍药材质量的水，置不锈钢桶浸泡4 h，待药材充分吸胀后，置并联式中药膏方浓缩制备系统中煎煮3 次，每次煎煮1 h，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.2 ～1.3 的稠膏，分装至玻璃广口瓶中，待凉膏后密封保存。取供试品，105 ℃下真空干燥3 h 后，冷却至室温，取0.5 g，精密称定，加甲醇20 mL，超声处理30 min，滤过，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

表1 卵巢护养膏微生物限度检测结果（cfu／mL）

阴性对照品溶液：按处方比例称定除淫羊藿外的所有药材，按供试品溶液方法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：分别取2.2.2 项下3 种溶液，按拟订色谱条件进样分析，记录色谱图。结果阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。色谱图见图1。

线性关系考察：精密吸取不同体积的对照品溶液，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得质量浓度为180，120，90，45，15 μg／mL 的系列溶液。按拟订色谱条件测定峰面积，以对照品质量浓度（X，μg／mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y＝39 862X＋82.18，r＝0.999 9（n＝5）。结果表明，淫羊藿苷质量浓度在15 ～180 μg ／mL 范围内与峰面积线性关系良好。

检测限与定量限确定：精密量取质量浓度为15.0 μg ／mL 的对照品溶液1 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。依次改变进样量，测定检测限和定量限。信噪比（S／ N）约为1 ∶3 时，进样量为5 μL，测定检测限绝对值为7.5 ng；S／ N约为1 ∶10 时，进样量为20 μL，测定定量限绝对值为30 ng。

精密度试验：精密吸取质量浓度为90μg／mL 的对照品溶液，按拟订色谱条件连续进样6 次，记录淫羊藿苷的峰面积。结果的RSD为1.05%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批供试品溶液，分别于制备后0，2，4，6，8，12 h 时进样，记录淫羊藿苷峰面积。结果的RSD为1.27%（n＝6），表明供试品溶液12h 内稳定性良好。

重复性试验：取同一批样品，依法平行制备6 份供试品溶液，记录淫羊藿苷的峰面积。结果的RSD为1.03%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（ 批号为1080601）6 份，每份约0.25 g，精密称定，分别按样品含量－加入量1 ∶1 的比例加入一定量的对照品溶液，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定，计算回收率。结果见表2。

表2 淫羊藿苷加样回收试验结果（ n ＝6）

2.3 相对密度测定

按2015年版《中国药典（四部）》通则0183[12]煎膏剂项下规定，取3 批供试品，每批各3 瓶，进行相对密度测定。结果样品相对密度在120 d 内稳定，详见表3。

图1 高效液相色谱图

表3 卵巢护养膏贮存期间相对密度质量研究结果

2.4 贮存期间质量研究

取3 批供试品，常温下贮存120 d，使用清洁的干燥药匙，分别在第0，10，20，30，60，90，120 天抽样，检测其淫羊藿苷的含量。结果见表3。可见，淫羊藿苷含量在90 d内相对稳定，第120 天略有下降。

3 讨论

本研究中分别以甲醇和稀乙醇为溶剂，超声提取30 min，结果甲醇提取的供试品溶液中淫羊藿苷含量更高，故确定甲醇为提取溶剂。分别超声提取10，20，30，40 min，结果测得淫羊藿苷含量最高的是提取30 min 与40 min，故选择甲醇超声提取30 min 作为供试品溶液的制备方法。以不同比例的甲醇－水、乙腈－水为流动相进行试验，结果流动相为乙腈－水（30 ∶70，V／ V）时理论板数更高，分离度更好，故选择乙腈－水（30 ∶70，V／ V）为流动相。

中药膏方对原料来源、制作工艺、贮存容器要求较高，质量控制不当易导致膏方贮存期间微生物限度超标。相对密度是评价膏方质量的指标之一，可间接反映中药膏方的含水量，相对密度越低，含水量越高的膏方更易霉变[13－15]。故本研究中以微生物限度及相对密度为卵巢护养膏的质量评价指标，考察其贮存过程含水量的变化。

卵巢护养膏在贮存过程相对密度始终维持在1.2 ～1.3 间，此状态下膏方表面光滑，流动性好，口感光滑。贮存期间微生物限度考察合格，表明膏方在此含水量下可长期存放，符合质量控制要求。同时说明其包装容器可有效隔绝外界水分侵入，防止微生物滋生，为包装的选用提供了有力的佐证。贮存期间淫羊藿苷含量测定结果发现，其在90 d 内稳定，此后开始下降，降幅约为10%，故卵巢护养膏在常温下的保存期限以120 d为宜。改变贮存条件是否会对其保存期限造成影响，需在下一步的试验设计中完善。