聚合酶链式反应法筛选龙胆栽培品最佳采收期*

吴艳蓉，贾凌云

（1. 辽宁省沈阳市肛肠医院药剂科，辽宁 沈阳 110002； 2. 沈阳药科大学中药学院，辽宁 本溪 117004）

采收期是指中药材的采收时间，中药材的采收期对其有效成分含量、制剂质量、临床疗效等均有直接影响[1]。龙胆始载于《神农本草经》，被列为中品。陶弘景曰：“……根状似牛膝，味甚苦，故以胆为名。”中药龙胆为龙胆科植物条叶龙胆Gentiana manshuricaKitag.、龙胆Gentiana scabraBge、三花龙胆Gentiana trifloraPall. 或坚龙胆Gentiana rigescensFranch. 的干燥根和根茎[2]。本研究中应用以聚合酶链式反应（PCR）为基础的分子标记技术，建立了辽宁省道地药材龙胆Gentiana scabraBge.栽培品的种质标准，并确定了筛选的龙胆栽培品最佳采收期。现报道如下。

1 龙胆栽培品种质标准的建立

1.1 仪器与试药

仪器：PTC100TM型PCR 仪（Programmable Thermal Controller MJ Research Inc USA）；DYY－Ⅲ23A 型电泳槽，ECP3000 型三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂）；TGL－16G 型台式高速离心机（上海医用分析仪器总厂）；UV755B 型紫外可见分光光度计（上海分析仪器总厂）。

试药：十二烷基硫酸钠（SDS） 提取缓冲液[100 mmol／L NaCl，50 mmol／L 乙二胺四乙酸（EDTA，pH 8.0），50 mmol／L 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris－HCl，pH 8.0），0.5%SDS，0.8% β－Me，dNTPs，缓 冲 液（buffer）]，Taq DNA 聚 合 酶，随 机 扩 增 多 态 性DNA（RAPD）随机引物，溴化乙啶（EB），均购自上海生物工程有限公司；DNA Maker 购自天根生化科技（北京）有限公司；蒸馏水为无菌重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。龙胆栽培品（共5 批，产地均为辽宁省清原县）；坚龙胆对照药材（批号为120988－200403），龙胆对照药材（批号为121530－201602），龙 胆 苦 苷 对 照 品（批 号 为110770－201716），均购自中国食品药品检定研究院。

1.2 方法学考察

供试品提取溶剂的制备：分别采用SDS 法、CTAB法、高盐低pH 法提取龙胆药材，将提取的总DNA 溶液稀释后，用紫外可见分光光度计于260 nm 及280 nm 波长处测定吸光度（A）。结果SDS 法最佳，详见表1。

表1 SDS 法提取紫外检测结果

模板、引物、酶用量对RAPD 扩增的影响：结果见表2。可见，确定RAPD 扩增最佳条件为模板含量28 ～30 ng，引物量20 ng，酶用量1.5 ～2.0 U，94 ℃预变性3 min，94 ℃10 s，36 ℃35 s，72 ℃70 s，43 个循环，72 ℃保温5 min[3]。

表2 模板、引物、酶用量考察结果

1.3 溶液制备

取0.2 g 供试药材，置研钵，用液氮冷却，研成细粉，置2 mL Epperdorf 管中，加入400 μL SDS 提取缓冲液，56 ℃温浴30 min，加入等体积的苯酚－氯仿－异戊醇（25 ∶24 ∶1，V／ V／ V）抽提，混匀，以10 000 r／min 离心5 min，吸取上清液，置另1 支2 mL Epperdorf 管中，用上述抽提液重复抽提，直至蛋白沉淀完全为止，吸取上清液，与2 倍体积无水乙醇混匀[3]，于－20 ℃放置20 min，离心，得沉淀。用70%乙醇洗涤2 次，干燥，溶于无菌重蒸馏水中，得供试品溶液。分别取坚龙胆及龙胆对照药材各0.2 g，依法分别制成对照药材溶液。

1.4 DNA 扩增与检测结果

分别以供试品溶液及对照品溶液为模板，引物为50 种RAPD 随机引物，进行RAPD 反应，反应总体积为25 μL，置PTC－100 型PCR 仪上扩增。反应成分：buffer（Mg2＋），400 μm dNTPs，2 U Taq 酶，20 ng 引物，30 ng 模板；反应程序：94 ℃预变性3 min，94 ℃10 s，36 ℃35 s，72 ℃70 s，43 个循环，72 ℃保温5 min。反应结束后，通过1.4%琼脂糖凝胶电泳进行检测，在紫外透射反射条件下观察结果、照相，并将扩增产物长度与DNA Marker进行比较[3]。结果在与对照药材龙胆相应位置出现相同的条带，与对照药材坚龙胆有显著差异，可作为龙胆（栽培品）的种质标准。龙胆DNA 指纹图谱见图1。

图1 龙胆DNA 指纹图谱

2 龙胆栽培品最佳采收期的确定

2.1 仪器与试药

仪器：LC－10AT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Diamosil C18柱（迪马公司）；DL－360 型超声波清洗器（浙江省象山县石浦海天电子仪器厂，功率为180 W，频率为30 ～40 kHz）。

试药：甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。生长年限为2 ～5年的龙胆栽培品。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Diamosil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇－水（24 ∶76，V／ V）；流速：1.0 mL／min；检测波长：270 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。理论板数按龙胆苦苷峰计不低于3 000，与相邻峰的分离度大于1.5，系统适用性良好。

2.3 溶液制备

对照品溶液：取龙胆苦苷对照品2 mg，精密称定，置10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成质量浓度为0.2 g／L 的溶液，即得[2]。

供试品溶液：取龙胆粉末0.5 g（过4 号筛），精密称定，精密量取甲醇20 mL，置同一具塞锥形瓶中并称定质量，加热回流15 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液备用，精密量取续滤液2 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得[2]。

2.4 方法学考察

线性关系考察：取龙胆苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制得质量浓度为0.05，0.10，0.20，0.40，0.80 g／L 的对照品溶液，分别精密吸取10 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以龙胆苦苷质量浓度（X）为横坐标、相应峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回 归 方 程Y＝600 722 882.258 1X＋3 401 944.5，r2＝0.999 6（n＝5）。结果表明，龙胆苦苷质量浓度在0.05 ～0.80 g／L 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液，重复进样6 次，每次10 μL，记录龙胆苦苷峰面积。结果的RSD为1.52%（n ＝6），表明仪器精密度符合要求。

重复性试验：取6 份样品各0.5 g，精密称定，依法制备供试品溶液，进样测定龙胆苦苷的含量。结果的RSD为1.61%（n ＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液，分别于0，1，2，4，8，12 h 时进样测定，记录龙胆苦苷峰面积。结果的RSD为1.96%（n ＝6），表明供试品溶液在制备后12 h 内稳定。

加样回收试验：取已知含量的样品0.5 g，精密称定，共3 份，按高、中、低分别加入龙胆苦苷对照品，依法制备供试品溶液，依法测定并计算回收率。结果见表3。

2.5 样品含量测定

取经筛选的龙胆栽培品，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，色谱图见图2。5 批样品的含量分别为4.29%，4.53%，4.48%，4.27%，3.93%。

表3 龙胆苦苷加样回收试验结果（n ＝9）

图2 高效液相色谱图

2.6 最佳采收期确定

4 个批次不同采收季节和4 个批次不同生长年限的龙胆栽培品中龙胆苦苷的含量变化见图3。

3 讨论

中医取龙胆苦寒之性，泻肝胆实火，除下焦湿热[4]。东北的关龙胆以产量最大、质量最好成为药材市场的主流而行销全国，并有出口[5－6]。中药龙胆中最主要的有效成分为龙胆苦苷等环烯醚萜苷类化合物[7－8]，具有抗病毒、抗肿瘤、保肝利胆等生物活性[6]。故本研究中以龙胆苦苷为指标成分，对应用PCR 法进行筛选的辽宁省道地药材龙胆Gentiana scabraBge. 栽培品进行最佳采收期研究。

关于龙胆苦苷的HPLC 含量测定方法，以甲醇－磷酸水溶液系统为流动相进行梯度洗脱，270 nm 为检测波长[9]；以乙腈－磷酸水溶液系统为流动相，240 nm 为检测波长[10－11]；文献[12－16]和2015年版《中国药典（一部）》中均以甲醇－水系统为流动相，270 ～275 nm 为检测波长测定龙胆苦苷。本研究中参考以上文献，对龙胆苦苷测定方法进行筛选，最终确定甲醇－水（24 ∶76，V／ V）为流动相，以270 nm 为检测波长。

图3 不同采收季节和生长年限龙胆栽培品中龙胆苦苷含量

由龙胆苦苷的含量测定结果可见，秋季采收的龙胆栽培品中龙胆苦苷含量高于春季采收的龙胆栽培品，但二者含量均高于2015年版《中国药典（一部）》龙胆药材项下规定的龙胆苦苷含量[2]，故春秋两季均可采收。生长年限为2 ～5年的龙胆栽培品中，以3年生长龙胆苦苷含量最高，故确定龙胆栽培品的最佳生长期为3年。

近年来，我国野生中药材资源呈明显下降趋势，特别是道地药材的野生资源日益匮乏，拯救和保护濒危中药材资源刻不容缓，没有科学指导的移栽品更是降低了临床疗效[11，17]。优良的种质资源是道地药材品质形成的内因，对优良种质资源进行筛选和深入研究，有助于对道地药材优良品种的推广和发展。RAPD 是目前用于作物种质资源鉴定的一种分子标记技术[18]。PCR 法是DNA 分子水平PCR，被称为检测基因多态性的常规技术，代表中药品种变异类型的遗传标记。故本研究中采用PCR 法测定龙胆种质标准。应用PCR法筛选龙胆栽培品简单易行，结果可靠，可据此探索建立道地中药材种子的PCR 法筛选标准，以筛选优良的中药材种质资源，推广道地中药材的规范化种植。这对于挽救中药资源的流失和枯竭，促进中药资源的保护和发展，提高中药质量标准制订水平均有重要意义。