珠芽景天不同部位提取物抗小鼠急性肝损伤的作用研究*

吴莹莹，李 银，马 雪，郑 林，姚成芬，李勇军，林昌虎△

（1. 贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心·省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550004； 2. 贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550004； 3. 贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室，贵州 贵阳 550004）

珠芽景天为景天科景天属植物珠芽景天Sedum bulbiferum Makino的干燥全草，广泛分布于广东、广西、湖南、四川、贵州等省，主要生长于贵州道真、毕节、清镇等地区，是贵州省民间常用药材。文献记载其用于治疗食积腹痛、风湿瘫痪、寒热疟疾等症[1－3]。目前，已分离出黄酮类、生物碱、多糖、三萜类、矿质元素[4－8]等多种化学成分。本课题组在前期进行了珠芽景天的化学成分分离研究[9]，发现珠芽景天中含多种黄酮类成分。黄酮类化合物是一类具有多种生物学活性的天然产物，具有抗炎[10]、抗氧化[11]、抗病毒[12]等药理活性，在防治肝脏疾病等方面发挥着重要作用[13]。《湖南药物志》记载，珠芽景天可用于治疗慢性肝炎[14]。目前，国内外对珠芽景天的保肝活性研究尚未见报道。本研究中以经典的四氯化碳（CCl4）致小鼠急性肝损伤模型进行试验，通过观察小鼠血清和肝组织中相关生化指标的变化、肝组织病理变化，对珠芽景天保肝有效部位进行筛选，为全面开发利用珠芽景天提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

1.1.1 仪器院孙庆文教授鉴定为景天科景天属植物珠芽景天Se-dum bulbiferum Makino的干燥全草。D101 净品型大孔树脂（天津农药股份有限公司树脂分公司）；CCl4（分析纯，上海申博化工有限公司，批号为20151214）；金龙鱼玉米油（益海嘉里食品营销有限公司）；0.9%氯化钠注射液（贵州科伦药业有限公司，批号为E118072407）；甲醛溶液（分析纯，重庆江川化工有限公司，批号为20170221）；75%乙醇（分析纯，四川金山制药有限公司，批号为20170221）；无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号为20180423）；双环醇片（北京协和药厂，批号为180402）；羧甲基纤维素钠（成都金山化学试剂有限公司，批号为20151123）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒、天门冬酸氨基转移酶（AST）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

1.1.3 动物

SPF 级KM 小鼠，120 只，雌雄各半，体质量（20±2）g，购自长沙天勤生物技术有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2014－0011。适应性饲养1 周，饲养于温度为（22±2）℃、相对湿度为45% ～60%的动物房内。

UV －2700 型紫外可见分光光度计（岛津仪器苏州有限公司）；Varioskan LUX 型全波长酶标仪（美国Thermo 公司）；Multifuge X3R 型高速冷冻离心机（美国赛默飞世尔科技有限公司）；BCD－258WDPM 型冰箱（青岛海尔股份有限公司）；BSM 220.4 型电子天平（上海卓精电子科技有限公司，精度为万分之一）；IMS－20型制冰机（常熟市雪科电器有限公司）；XW－80A 型漩涡混合器（江苏海门麒麟医用仪器厂）；KZ－20L 型超纯水机（上海科制环保设备有限公司）；十字柄玻璃组织匀浆器（南通市卫宁实验器材有限公司）。

1.1.2 试药

珠芽景天药材采自于贵州省清镇市，经贵阳中医学

1.2 方法

1.2.1 珠芽景天不同极性组分制备

取干燥的珠芽景天药材1 kg，以70%乙醇回流提取2 次，第1 次10 倍量体积提取2 h，第2 次8 倍量体积提取1.5 h，过滤，合并滤液，减压回收溶剂得浸膏150 g。将D101 净品型大孔吸附树脂用乙醇浸泡24 h，2 倍柱体积乙醇洗涤后，3 倍柱体积水洗，备用。浸膏加水溶解，上柱，依次用水、50%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，回收各部分洗脱液，并浓缩成干浸膏，得水洗脱部位60 g，50%乙醇洗脱部位37 g，95%乙醇洗脱部位9 g，备用。

1.2.2 分组、造模及给药

将KM 小鼠随机分为12 组，每组10 只，分别为正常对照组、模型组、双环醇组（阳性对照组，0.2 g／kg），以及水段高、中、低剂量组（以生药量计分别为16.38，10.92，5.46 g／kg），50%乙醇段高、中、低剂量组（以生药量计分别为10.08，6.72，3.36 g／kg），95%乙醇段高、中、低剂量组（以生药量计分别为2.46，1.64，0.82 g／kg）。正常对照组和模型组小鼠给予0.5%羧甲基纤维素钠，其余组小鼠分别给予相应药物，每天1 次，连续灌胃7 d，末次给药2 h 后。正常对照组小鼠腹腔注射玉米油10 mL／kg，其余各组小鼠均按10 mL／kg 体质量腹腔注射0.1% CCl4玉米油混合液制备急性肝损伤模型。造模后，禁食不禁饮，成模16 h 后摘取小鼠眼球，取血，颈椎脱臼处死小鼠，并分离小鼠肝脏组织，备用。

1.3 观察指标

ALT 及AST 的检测：将采集的小鼠全血室温下静置1 ～2 h，3 500 r／min 离心10 min，取上层血清备用。按试剂盒说明书操作检测血清中ALT 和AST 的活性。

肝脏MDA 含量检测：取小鼠肝脏0.2 g，置1.8 mL生理盐水中，冰水浴条件下匀浆，制成10%肝匀浆溶液，3 000 r／min 离心10 min，取上清液备用。先按BCA蛋白定量试剂盒说明书操作，得到蛋白浓度，再按MDA试剂盒说明书操作，根据公式计算MDA 含量。

肝组织病理切片：将新鲜小鼠肝脏置10%甲醛固定，切成0.2 ～0.5 cm 薄片，用70% ～100%乙醇梯 度洗脱、二甲苯透明处理、石蜡包埋，制成厚约3 μm 的薄片。二甲苯脱蜡，苏木精－伊红（HE）染色，脱水，透明，干燥，封片，显微镜下观察肝组织切片的病理学变化。

1.4 统计学处理

采用SPSS 19.0 统计学软件分析。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠血清ALT 和AST 及肝组织MDA 含量

结果见表1。与正常对照组比较，模型组小鼠ALT和AST 活性显著升高（P ＜0.01），表明急性肝损伤模型复制成功；与模型组比较，双环醇组和珠芽景天50%乙醇段中、高剂量组CCl4所引起的ALT 和AST 活性升高均明显降低（P ＜0.05）。与正常对照组比较，模型组小鼠肝组织MDA 含量显著升高（P ＜0.01）；与模型组比较，双环醇组和珠芽景天50% 乙醇段中、高剂量组MDA 含量显著降低（P ＜0.05）。

表1 珠芽景天对CCl4 致小鼠急性肝损伤血清ALT，AST 及肝组织MDA 含量的影响（±s，n ＝10）

表1 珠芽景天对CCl4 致小鼠急性肝损伤血清ALT，AST 及肝组织MDA 含量的影响（±s，n ＝10）

注：与正常对照组比较，△P ＜0.01；与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

组别正常对照组模型组双环醇组水段 高剂量组中剂量组低剂量组50%乙醇段 高剂量组中剂量组低剂量组95%乙醇段 高剂量组中剂量组低剂量组剂量（g／kg）0.20 16.38 10.92 5.46 10.08 6.72 3.36 2.46 1.64 0.82 ALT（U／L）36.09±7.42 177.84±19.75△59.03±15.19**173.09±19.88 161.11±33.67 167.44±11.49 103.59±33.26**148.50±30.59*165.38±10.65 167.23±5.56 169.55±23.45 158.78±18.53 AST（U／L）46.33±28.58 151.35±30.81△86.95±23.08**143.74±17.63 140.05±33.78 157.96±23.69 94.08±32.97**104.37±40.24**119.59±38.71*141.71±37.77 147.88±29.35 143.47±30.42 MDA（nmol／mL）1.47±0.4 2.27±0.48△1.41±0.43**1.95±0.49 2.34±0.40 1.86±0.94 1.73±0.33**1.80±0.30*2.37±0.36 2.22±0.42 2.19±0.28 2.33±0.44

2.2 肝损伤模型小鼠肝组织形态学观察

图1 珠芽景天对CCl4 致小鼠急性肝损伤肝脏病理学的影响（HE，×200）

结果见图1。正常对照组小鼠肝细胞结构清晰，肝细胞核大而圆，核仁明显，核膜清晰，无细胞变性坏死；与正常对照组比较，模型组肝细胞变性坏死，肝细胞肿胀较明显，大量炎性细胞产生，说明CCl4诱导小鼠急性肝损伤模型复制成功；双环醇组和给药组较模型组虽仍有部分病变，但炎性细胞减少，肝小叶结构较完整，排列整齐，表明双环醇组和珠芽景天50%乙醇段高、中、低剂量组均对CCl4诱导小鼠急性肝损伤具有一定保护作用。

3 讨论

通过高效液相色谱及提取物重量分析，珠芽景天提取物的水、50%乙醇、95%乙醇洗脱部位基本无交叉，分段效果较好，各部分含有的化学成分不相同，可用该方法进行珠芽景天不同部位提取物对急性肝损伤模型小鼠的保护作用研究。对各洗脱部位的化学成分分析表明，50%乙醇洗脱部位中主含黄酮类成分，提示珠芽景天50%乙醇洗脱部位的保肝活性与黄酮类物质密切相关。

CCl4急性肝损伤模型是经典的化学性肝损伤模型，是研究保肝活性试验的首选模型。CCl4在肝脏生成三氯甲基自由基，导致肝细胞微粒体膜脂质过氧化，致肝细胞受损[15]。胞质内ALT 和AST 大量释放进入血液，使血液中ALT 和AST 活性升高[16－17]，故血清ALT 和AST一定程度上能反映肝脏的损伤程度[18]。造模时选择0.1%和0.2% CCl4玉米油溶液，按10 mL／kg 体质量腹腔注射造模[19]，结果表明，0.1%和0.2% CCl4玉米油溶液均能引起小鼠血清ALT 和AST 升高，升高程度呈明显的剂量依赖性，考虑过高剂量会引起动物死亡，故选择0.1% CCl4。结果表明，模型组较正常对照组小鼠血清ALT 和AST 活性显著升高，结合组织病理切片检查，表明CCl4所致小鼠急性肝损伤模型复制成功。参考文献[20]，结合预试验考察结果，在0.1%剂量的CCl4玉米油溶液处理后16 h 血清转氨酶水平达峰值，小鼠肝损伤程度较合适、肝损伤模型稳定，较易反映药物的保肝降酶作用，因此选择建立模型后16 h 为测定转氨酶水平的时间点。

根据临床剂量及试验结果，选择提取物干浸膏能溶解于羧甲基纤维素钠的最大量（约临床剂量的60 倍）作为给药剂量，结果表明，保肝效果明显，和模型组相比差异有统计学意义。故本试验的给药剂量设计为以珠芽景天临床剂量的60 倍、40 倍和20 倍。

本研究结果显示，珠芽景天50%乙醇段对CCl4诱导小鼠急性肝损伤有保护作用，与模型组比较，珠芽景天50%乙醇段小鼠血清中ALT 和AST 活性明显降低（P ＜0.05）。MDA 可反映体内脂质过氧化的程度及细胞损伤情况。与模型组比较，珠芽景天50%乙醇段高、中剂量组小鼠肝脏MDA 含量明显降低（P ＜0.05）。结合病理切片检查结果，可见珠芽景天50%乙醇段对CCl4致小鼠急性肝损伤有保护作用，可为珠芽景天化学成分和物质基础的研究提供参考。