DNA甲基转移酶1和GJB2基因多态性与突发性聋易感性研究*

张岩岩 刘华 宋扬 郭海艳

突发性聋(sudden sensorineural hearing loss，SSHL)病因和发病机制尚不清楚，主要假说包括：血管闭塞、病毒感染、迷路膜破裂、免疫介导机制和耳蜗内异常细胞应激反应[1～4]。DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)是甲基化的催化剂，在染色质重塑和基因表达调控中起关键作用[5]。DNMT1主要参与甲基化的维持状态，也是甲基化状态延长所必需的[6]，有研究显示DNMT1基因突变可引起一种神经退行性疾病，伴有痴呆和感音神经性听力损失[7]。有研究提出，在耳蜗中，含有GJB2编码连接蛋白26(CX26)蛋白的间隙连接通过在听觉转导期间将K+从毛细胞运送而维持体内K+平衡[8]。国外有研究者发现，DNMT1基因rs2228612位点AA基因型是特发性突发性感音神经性聋(ISSHL)患者的危险因素，GG基因型可能是rs2228612多态性的保护因子[9]。此外，还有研究发现，GJB2基因rs55704559位点与听力损失的发生相关[10]。因此，本研究分析DNMT1基因rs2228612位点和GJB2基因rs55704559位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与SSHL易感性的相关性，报告如下。

1 资料与方法

1.1研究对象及分组 选择2014年5月至2018年10月期间唐山市工人医院收治的185例突聋患者作为研究组，诊断标准参考2005年中华医学会耳鼻咽喉头颈外科分会制定的突聋诊断标准；同时招募185例听力正常人作为对照组，两组年龄、性别、体重指数(body mass index，BMI)、吸烟史、饮酒史等差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性(表1)。排除糖尿病、高血压、家族性高血脂、中耳炎以及听神经瘤等患者。所有受试者均签署了知情同意书，本研究通过了医院医学伦理委员会的批准。

表1 研究组和对照组年龄、性别、BMI、吸烟及饮酒史比较

1.2基因检测方法 采集所有受试者外周血2 ml，使用血液组织细胞基因组提取试剂盒[货号DP304-02/03，天根生化科技(北京)有限公司]提取基因组DNA，保存于-70 ℃冰箱待测。设计PCR扩增引物，其中DNMT1基因rs2228612位点PCR扩增引物序列为：上游：5’-AAA AGT GAG ACC TTT ACC TTT TCA T-3’，下游：5’-AGG CCC GAA GAA AAA GAA CC-3’。GJB2基因rs55704559位点PCR扩增引物序列为：上游：5’-TGC AAC CAT TTG AAA CCC CTG-3’，下游：5’-TTA GGG GAG CAG AGC TCC AT-3’。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系为20 μl，其中基因组DNA 20 ng，10×PCR buffer 2 μl，25 mmol/L 的Mg2+1.5 μl，10 μmol/L dNTP 1 μl，10 pmol/L的上、下游引物各1 μl，0.25 μl DNA聚合酶，用无菌水补足20 μl。PCR反应条件为：95℃，5 min；94℃，20 s；60℃，30 s；72℃，30 s，30个循环；72℃，5 min；4℃保存。PCR完成后将PCR扩增产物纯化后寄送上海生工生工生物工程技术公司进行测序。

1.3统计学方法 本研究中统计学分析使用SPSS 20.0软件(IBM, Chicago, IL)，连续变量的表示方法为(mean±SD)，统计学分析采用独立样本t检验。分类变量用百分比[n(%)]表示，使用χ2检验进行统计学分析。对照组基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡(HWE)采用χ2检验分析。采用非条件Logistic回归分析并使用比值比(OR)和95%置信区间(CI)分析基因型和等位基因与SSHL风险相关性，所有检测均是双尾，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1DNMT1和GJB2基因SNP与SSHL风险相关性 PCR扩增产物测序结果见图1。DNMT1基因rs2228612位点和GJB2基因rs55704559位点各基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。DNMT1基因rs2228612位点各基因型频率在研究组和对照组之间的差异有统计学意义(χ2=7.13,P=0.03)，以野生型TT为参考，TC基因型与SSHL风险间无相关性(OR=0.78，95%CI：0.48～1.26，P=0.28)，而CC基因型是SSHL风险的保护因素(OR=0.45，95%CI：0.23～0.85，P=0.01)。研究组DNMT1基因rs2228612位点C等位基因频率显著低于对照组，差异有统计学意义(χ2=7.35，P=0.01)，C等位基因是SSHL的保护因素(OR=0.66，95%CI：0.49～0.90，P=0.01)。研究组和对照组GJB2基因rs55704559位点不同基因型之间的差异有统计学意义(χ2=7.73,P=0.02)，以野生型AA为参考，AG基因型与SSHL风险无相关性(OR=1.49，95%CI：0.88～2.54，P=0.12)，GG基因型是SSHL发生的危险因素(OR=3.48，95%CI：1.14～11.31，P=0.01)，研究组患者的GJB2基因rs55704559位点G等位基因频率显著高于对照组，差异有统计学意义(χ2=8.95,P<0.01)，G等位基因是SSHL发生的危险因素(OR=1.84，95%CI：1.21～2.80，P<0.01)(表2)。

表2 DNMT1和GJB2基因SNP位点基因型和等位基因频率在两组的比较(例，%)

2.2DNMT1和GJB2基因多态性与性别的相互作用对突聋易感性的影响 在男性群体中，以野生型为参考，DNMT1基因rs2228612位点突变基因型是SSHL的保护因素(OR=0.52，95%CI：0.28～0.97，P=0.03)，GJB2基因rs55704559位点突变基因型与SSHL风险无相关性(OR=1.12，95%CI：0.58～2.17，P=0.72)。在女性群体中，同样以野生型为参考，DNMT1基因rs2228612位点突变基因型与SSHL风险无相关性(OR=0.80，95%CI：0.39～1.63，P=0.50)，GJB2基因rs55704559位点突变基因型是SSHL的危险因素(OR=3.38，95%CI：1.48～7.83，P<0.01)(表3)。

表3 不同性别受试者DNMT1和GJB2基因型频率在两组比较(例，%)

2.3DNMT1和GJB2基因多态性与吸烟的相互作用对突聋易感性的影响 在吸烟群体中，以野生型为参考，DNMT1基因rs2228612位点突变基因型是SSHL的保护因素(OR=0.39，95%CI：0.16～0.96，P=0.02)，GJB2基因rs55704559位点突变基因型是SSHL的危险因素(OR=3.28，95%CI：1.31～8.33，P=0.01)。在不吸烟的群体中，同样以野生型为参考，DNMT1基因rs2228612位点突变基因型与SSHL风险无相关性(OR=0.78，95%CI：0.46～1.32，P=0.32)，GJB2基因rs55704559位点突变基因型与SSHL风险没有相关性(OR=1.41，95%CI：0.75～2.66，P=0.25)(表4)。

表4 吸烟与不吸烟受试者DNMT1和GJB2基因型频率在两组的比较(例，%)

2.4DNMT1和GJB2基因多态性与饮酒的相互作用对突聋易感性的影响 在饮酒群体中，以野生型为参考，DNMT1基因rs2228612位点突变基因型与SSHL风险无相关性(OR=0.76，95%CI：0.34～1.73，P=0.48)，GJB2基因rs55704559位点突变基因型是SSHL的危险因素(OR=2.43，95%CI：1.03～5.77，P=0.03)。在不饮酒的群体中，同样以野生型为参考，DNMT1基因rs2228612位点突变基因型与SSHL风险无相关性(OR=0.62，95%CI：0.36～1.06，P=0.06)，GJB2基因rs55704559位点突变基因型与SSHL风险无相关性(OR=1.40，95%CI：0.97～1.77，P=0.06)(表5)。

表5 饮酒与不饮酒受试者DNMT1和GJB2基因型频率在两组比较(例，%)

3 讨论

研究SSHL的发生内在病因对突聋的预防和治疗具有重要意义，遗传因素可能是一个值得考虑的方向，有研究报道多种基因多态性与听力损伤的风险增加或降低有关[11,12]。DNMT1是维持甲基转移酶，其在细胞复制期间将甲基基团连接至半甲基化DNA。最近，有研究者发现DNMT1突变通过降低甲基转移酶活性并削弱它们在第二个间隙(G2)期对异染色质的组合能力，引起一种神经退行性疾病，伴有痴呆和感音神经性听力损失[7]。DNMT1基因位于染色体19p13.3-p13.2，包括两部分，一部分是大的N-末端调节区，另一部分是较小的C-末端催化区[13]。有研究调查了DNMT1多态性与相关疾病风险之间的关联性，包括乳腺癌[14]，乙型肝炎病毒(HBV)感染[15]等。然而，目前关于DNMT1基因多态性与SSHL的相关性研究较少。本研究结果显示，DNMT1基因rs2228612位点CC基因型是SSHL风险的保护因素(OR=0.45，95%CI：0.23～0.85，P=0.01)，携带突变型C等位基因的人群发生SSHL的风险相对较低。分析原因可能为DNMT1中rs2228612位点突变促进DNMT1的表达、提高酶活性，从而降低中枢神经系统和周围神经系统神经退行性疾病的发生。Kullmann等[16]研究显示DNMT1基因rs2228612位点G等位基因与降低患乳腺癌的风险相关，说明DNMT1基因rs2228612位点G等位基因可能是疾病发生的保护因素。另外本研究结果显示，仅男性、吸烟群体中G等位基因是SSHL的保护因素，说明DNMT1基因rs2228612位点SNP与SSHL的相关性可能与环境因素有关。

有研究报道显示，GJB2突变与非综合征型听力损失的发生相关[16,17]。GJB2基因rs55704559(c.168A>G)位点位于GJB2 mRNA的茎环结构的内环中，mRNA 3'UTR中的调节基序似乎在特定二级结构的背景下起作用[18]，3'UTR中发生的茎环结构与基因表达有关，在mRNA稳定性水平上起作用[19]。本研究结果发现携带GJB2基因rs55704559位点G等位基因的人群发生SSHL的风险显著升高，分析可能原因为rs55704559位点A>G突变改变了mRNA 3'UTR的序列后，mRNA的结构发生了改变，mRNA的稳定性发生变化，导致GJB2的表达水平下降，而作为离子和代谢物质选择性通道成分之一的GJB2蛋白的表达水平下降必然影响正常听觉的形成。另外，本研究结果显示，在女性、吸烟、饮酒人群中观察到了GJB2基因rs55704559位点突变基因型是SSHL易感的危险因素，而在男性、不吸烟和不饮酒的人群中并未发现该现象，说明GJB2基因rs55704559位点对SSHL的影响可能与环境因素有关，由此说明SSHL的发生可能是基因与环境因素共同作用的结果。

综上所述，DNMT1基因rs2228612位点和GJB2基因rs55704559位点SNP与突聋易感性相关，这种相关性可能与性别、吸烟、饮酒状态等环境因素有关。本研究不足之处在于样本量较小，可能对统计分析的准确性有一定的影响；在样本的选择上可能存在一定的主观和客观偏倚，一定程度上可能会产生偏差，后期可以通过扩大样本量减小其分析误差，以进一步研究。