鹿源大肠杆菌的分离鉴定及生物学特性

于 莹，陈立志，王红梅，韩 坤，吕 娇，马 帅，白 雪*

(1.中国农业科学院 特产研究所，吉林 长春 130000；2.吉林特研生物技术有限责任公司，吉林 长春 130122;3.威海市文登区畜牧兽医技术服务中心,山东 威海 264400；4.吉林农业大学 动物科学技术学院，吉林 长春 130118)

大肠杆菌(Escherichiacoli)本是一种正常的肠道菌群，但当机体免疫功能下降时，可引起多种肠道内及肠道外疾病[1]。大肠杆菌引起的疾病在不同国家及地区都有发生，牛、羊感染大肠杆菌可引起腹泻疾病[2-3]；禽类感染大肠杆菌主要引起禽败血症、慢性呼吸道疾病、卵黄感染、大肠杆菌性肉芽肿等疾病[4]；毛皮动物感染大肠杆菌可引起流产等疾病[5]。大肠杆菌也是人眼炎的主要病原[6]，人感染大肠杆菌后可引起角膜炎、眼内炎及眼窝蜂窝织炎等疾病。鹿大肠杆菌病是对养鹿业危害严重的一种病，该病在临床上可引起鹿消化道感染及败血症等症状，甚至引起鹿死亡，给养鹿业带来较大的经济损失。并且随着抗生素的滥用，大肠杆菌的耐药率不断增加，耐药谱不断扩大，这为临床治疗鹿大肠杆菌病带来了困难。

近年来，由大肠杆菌导致的鹿源大肠杆菌病的报道较少，2018年7月，吉林省长春市张二路鹿场厂发生多只鹿死亡。我们对死亡的鹿进行剖检后发现，其肺部出血严重、肝肿大、质地脆弱、脾脏梗死、肠内容物充实呈褐色、肠黏膜有黑色出血点，经肝脏、肺脏涂布有单一病原菌。经16SrRNA测序鉴定为大肠杆菌，再此基础上，还完成了生物特性分析及药敏试验，为兽医临床治疗鹿大肠杆菌病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病料及试验动物病料样品采集自濒死期患病鹿肝脏、肺脏组织。体质量为(20±22) g的6周龄雌性BALB/c小鼠，购自长春生物制品研究所有限责任公司。

1.2 主要试剂蛋白胨、酵母粉、MH培养基、临床常用的抗生素药敏片均购自OXOID公司；细菌基因组提取试剂盒购自OMEGA公司；DL2000 DNA Marker、Ex Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司；肠菌科生化鉴定管购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；大肠杆菌标准阳性血清及引物分别购自生工生物工程(上海)有限公司。

1.3 细菌的分离培养及生化鉴定挑取死亡病鹿肝脏和肺脏病料划线接种于PYG平板，37℃培养12 h，挑取优势单菌落接种于5 mL PYG液体培养基中，37℃培养12 h，进行革兰染色，镜检。并按照肠菌科生化鉴定试剂盒说明书将分离纯化后菌株接种于半固体琼脂、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶肉汤、氨基酸脱羧酶等16种生化试剂中，37℃温箱培养24 h观察结果。

1.4 分离株分子生物学鉴定通过煮沸法获取分离株基因组DNA。将纯化后的分离株接种于PYG平板，划线培养过夜后，刮取1～2接种环菌苔加入150 mL三蒸水中混匀，100℃煮沸10 min，12 000 r/min离心10 min，上清液作为PCR模板，-20℃存储。

选取提取DNA为模板，以 27F/1429R 为引物对 16SrRNA 进行PCR扩增。PCR反应体系为20 μL：上、下游引物各1 μL，基因组DNA 1 μL，Ex Taq DNA 聚合酶10 μL。反应条件：95℃ 2 min；94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 40 s，25个循环；72℃，1 min。得到阳性产物送入生工生物工程(上海)有限公司测序，利用 BLAST 程序与 GenBank数据库中已知16SrRNA基因序列进行比对。并利用DNAStar和Mega5.05对分离菌株与部分大肠杆菌的核苷酸序列进行同源性比对并构建系统发育树。

1.5 血清型鉴定根据大肠杆菌菌属诊断试剂盒说明书，采用玻片凝集法，于洁净载玻片上滴加10 μL O型因子诊断血清，取适量菌落与血清混合，轻轻晃动玻片，1 min中内出现明显凝集为阳性，呈均匀混浊为阴性，阴性以无菌生理盐水作为对照。

1.6 人工感染小鼠试验挑取单菌落于5 mL PYG液体培养基中37℃、220 r/min震荡培养12 h，并进行菌落计数。将18～22 g 雌鼠随机分为3组，每组5只，分别腹腔注射1.04×107，1.04×106，1.04×105CFU等3个浓度菌液，0.2 mL/只。小鼠观察期7 d，记录每天死亡只数，采用Reed-Muench法计算LD50。

1.7 运动性测定挑取分离株菌落点中于LB半固体培养基(蛋白胨10 g、酵母5 g、NaCl 10 g及琼脂粉4 g溶于1 L蒸馏水中)上，于37℃培养12 h后，测量分离株运动圈的大小。

1.8 生物膜生成能力测定按照参考文献[7]并进行改进，方法如下：将分离株于PYG液体培养基中过夜培养后，将而培养好的菌液与培养基进行1∶200稀释，吸取200 μL稀释好的菌液到96孔平板中，每株做4个重复以及1个空白培养基的对照组，盖上盖子，37℃培养48 h。弃去培养基后，用无菌PBS溶液漂洗3遍。之后加入200 μL甲醇溶液，固定15 min，弃去甲醇溶液，室温下自然晾干。再加200 μL的结晶紫溶液，染色5 min，倒掉结晶紫，用自来水冲洗，直至洗净多余染液。此时在孔壁上可看见紫色环状生物膜，干燥若干小时，加入160 μL的33%冰醋酸，溶解生物膜，静置10 min，移液枪吹打几次后，转移到新96孔板中。读取570 nm出的D值。生物被膜形成标准为当D≤Dc时，结果为无(—)；当Dc

1.9 药敏试验药敏试验参照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)所述的K-B纸片法进行，选取22种常用抗生素。用浊度仪将过夜培养的菌液浊度调至0.5，之后均匀涂布于MH琼脂平板，静置后用无菌镊子取药敏片贴于平板表面，37℃培养18～24 h后，测量抑菌圈直径。

2 结果

2.1 细菌的分离培养及生化鉴定分离株接种于PYG固体培养基上，经37℃过夜培养后，生长出边缘整齐，表面光滑的白色菌落。挑取纯化后菌落，经革兰染色，镜检可发现大量两端钝圆的粉红色革兰阴性短杆菌(图1)。生化试验结果显示分离株对硫化氢、尿素酶、肌醇、核糖醇、MR-VP显阴性(表1)。此生化特性与大肠杆菌相似。

图1 革兰染色后的细菌形态

2.2 分离株分子生物学鉴定采用PCR方法扩增分离株16SrRNA基因片段，获得1 500 bp左右基因片段进行测序(图2)，结果显示该分离株与GenBank中登录的大肠杆菌多个参考株的同源性均为99%。经16SrRNA系统发育分析结果显示，进化树分为2个大分支，分离株Ed-102与其余7株大肠杆菌均不在同一分支上，但具有同一进化来源(图3)。

表1 生化试验结果

图2 16SrRNA PCR扩增结果 M.DL2000 DNA Marker；1.菌株Ed-102；2.阴性对照

图3 基于16SrRNA基因序列的系统发育分析

2.3 血清型鉴定结果血清型鉴定结果表明，分离株Ed-102与大肠杆菌O102型血清出现凝集，生理盐水对照不凝集。因此鉴定分离株为O102型大肠杆菌。

2.4 人工感染小鼠试验试验组小鼠攻读12 h后，开始死亡。发病小鼠主要症状为精神沉郁，被毛杂乱，眼睛有明显分泌物。剖检死亡小鼠，发现肝、肺及脾部有不同程度出血点，肠内容物充实。无菌采集小鼠肝、肺部接种于PYG固体培养基，18 h后获得单一病原菌，挑取单个菌落进行革兰染色，镜检发现此分离株与Ed-102形态一致。采用Reed-Muench法计算小鼠LD50为1.20×107CFU/只，对照组小鼠健康无异常(表2)。

2.5 运动性测定分离株经LB半固体培养基上培养12 h后，发现分离株在LB半固体培养基上可形成运动圈，直径大小为8.63 mm。

2.6 生物膜生成能力测定生物被摸能力测定结果表示，分离株Ed-102生物膜形成能力较弱(表3)。

表2 分离菌株Ed-102的LD50

表3 生物被膜检测结果

2.7 药敏试验药敏结果显示，分离株Ed-102对氨苄西林、哌拉西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、氨曲南、卡那霉素、链霉素、四环素、西诺沙星、萘啶酸及氯霉素耐药，对阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、妥布霉素中度耐药，仅对于阿米卡星及亚胺培南较为敏感(表4)。

表4 分离株的药敏试验

3 讨论

近几年，随着养鹿业的不断扩大，养殖密度的不断增加，细菌性疾病对养鹿业的影响也越来越大。然而，对于大肠杆菌引起的鹿腹泻及败血症疾病的研究却很少。本试验为探究鹿源大肠杆菌的生物特性、致病力及耐药情况，对分离株的运动能力、生物被膜形成能力、毒力以及耐药性进行了测定，为兽医临床治疗鹿大肠杆菌病提供理论依据。

研究表明，分离株Ed-102在显微镜下为两端钝圆的粉红色革兰阴性短杆菌，生化试验结果显示分离株对硫化氢、尿素酶、肌醇、核糖醇、MR-VP显阴性，此生化特性与大肠杆菌相似，进一步证明该分离株为大肠杆菌。经16SrRNA系统发育进化树表明分离株与7株大肠杆菌并不在一个分支上，但具有共同来源，这可能是菌株的宿主和地域的差异性所决定的，具体原因还需要进一步探讨。经玻板凝集试验表明，分离株为O102型大肠杆菌。研究表明，不同的血清型的大肠杆菌在一定条件下可引起人和动物感染不同疾病。其中O1、O2、O18和 O78型大肠杆菌是禽类患病的主要优势血清型[8]，O2、O8、O138、O139及O141型大肠杆菌为猪患病主要优势血清型[9]。而O102型大肠杆菌作为鹿源致病性大肠杆菌的优势血清型未曾报道过，说明O102可能作为鹿源致病性大肠杆菌的主要致病性血清型。

从分离株的运动特征可以发现，分离株Ed-102可在LB半固体培养基上形成直径为8.63 mm的运动圈，说明此分离株有运动性。生物膜是细菌在不利条件下存活所形成的特殊结构[10]。有研究表明，生物膜可以显著增强细菌对抗菌药物的抵抗能力且使慢性感染宿主疾病难以治愈的主要原因之一[11-12]。通过生物被膜检测发现，分离株的生物膜形成能力较弱，这可能与鹿源大肠杆菌为急性感染有关。人工感染小鼠试验结果显示，分离株Ed-102能引起小鼠后肝脏、肺脏不同程度的出血，其对小鼠的LD50达1.20×107CFU/只，说明此分离株致病力强，应引起足够的重视。

目前，由于抗生素在临床上的大量使用，加上使用不规范及使用方法不当，使得耐药菌株不断出现[13]。本试验选取22种抗生素进行药敏试验，发现分离株Ed-102对17种抗生素高度耐药，分别为氨苄西林、哌拉西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、氨曲南、卡那霉素、链霉素、四环素、西诺沙星、萘啶酸及氯霉素，对阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、妥布霉素中度耐药，仅对于阿米卡星及亚胺培南较为敏感。这与薛原等[13]对150株鹿源大肠杆菌耐药性测定结果相似，其测定的对对氨苄西林、四环素的高耐药率与对亚胺培南高敏感率与本试验结果一致。根据药敏试验结果，建议养殖户使用阿米卡星治疗患病鹿，并取得了良好的效果。综合来看，分离株Ed-102具有高耐药性，建议养殖户通过药敏试验筛选敏感药物治疗患病鹿，不要盲目使用抗生素，以免造成耐药，耽误病情。同时建议养殖户将病畜与健康动物隔离饲养，加强饲养管理并且搞好环境卫生，不要饲喂污染的饲料和水源。