检测猪瘟病毒E0抗体间接ELISA方法的建立及其初步应用

王 旭，蔡梦露，马振乾，陈 洁，龚文杰，常晓冉，张泽财，涂长春，王新平*

(1.吉林大学 动物医学学院/教育部人兽共患病研究重点实验室，吉林 长春 130062；2.青岛易邦生物工程有限公司，山东 青岛 266032；3.军事医学研究院 军事兽医研究所，吉林 长春 130122)

猪瘟(classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性的传染病[1]，为国家法定的一类动物疫病和OIE通报性疫病之一[2]，给养猪业造成了严重的经济损失。猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属的成员，是有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组约为12.3 kb[3-6]。猪瘟病毒只有1个血清型。根据病毒核苷酸序列的差异，病毒分为3个基因型，即基因1型、基因2型和基因3型[7]。病毒的基因组含有1个大的开放阅读框，可编码4种结构蛋白(C、E0、E1、E2)和8种非结构蛋白 (Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B)[8-10]。 在结构蛋白中，C蛋白为病毒的衣壳蛋白，E0、E1、E2为病毒的囊膜蛋白[11]。其中，E0蛋白由227个氨基酸组成，约为25 000，是诱导产生中和抗体的主要保护性抗原之一[12]。研究发现，E0蛋白具有RNA酶活性，可以水解宿主细胞内的RNA影响干扰素的表达从而引起病毒的持续感染[13]。E0蛋白可经细胞分泌到细胞培养基中，是一种分泌型蛋白，参与介导早期病毒对细胞的感染[14-15]。E0蛋白含有3个抗原表位，分别位于332～412，351～427和376～487位氨基酸，后2个抗原表位为构象表位[16]。序列比较分析发现，E0蛋白的氨基酸序列比E2序列更加保守，不同毒株之间的同源性较高[17]，是进行抗体检测的候选蛋白。

目前，国内预防猪瘟多采用新疆天康生物公司研制的猪瘟病毒E2亚单位疫苗[18]。该疫苗免疫后可以引导猪群产生针对E2蛋白的抗体，但应用检测E2抗体的试剂盒无法区分猪群中是否存在野毒感染。LANGEDIJK等[19]发现，在猪瘟野毒感染后，猪体内会产生针对E2、E0和NS2-3蛋白的抗体，而针对NS2-3蛋白的抗体不能用于鉴别诊断。DE SMIT等[20]发现，E2亚单位疫苗免疫猪在攻毒14 d后仍可以检测到E0蛋白的抗体，因此可通过检测E0蛋白的抗体确定猪群中是否存在野毒感染。本试验通过构建猪瘟病毒E0蛋白基因的2种原核表达载体，并应用表达纯化的GST-E0和His-E0重组蛋白作为包被抗原，建立了检测猪瘟病毒E0蛋白抗体的间接ELISA方法，并与IDEXX E2检测试剂盒平行检查部分临床样品；同时应用IFA方法，进一步确证了His-E0 ELISA方法与IDEXX E2试剂盒的检测结果，发现建立的检测E0抗体的间接ELISA方法具有特异性强、敏感性高和重复性好等特点，为临床上鉴别猪瘟病毒野毒感染提供了技术手段。

1 材料与方法

1.1 病料、血清、菌种及质粒猪瘟病料、猪瘟阳性和阴性血清由青岛易邦生物工程有限公司提供；猪瘟病毒疫苗C株由军事医学科学院军事兽医研究所所保存并提供；TOP10和BL21感受态细胞由本实验室保存；pGEX-4T-1和pET-28a原核表达载体由本实验室保存。

1.2 主要试剂限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、RNAiso Plus购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京聚合美生物科技有限公司；Proteinc Marker购自全式金生物技术有限公司；HRP标记羊抗猪IgG购自Immunoway公司；FITC标记羊抗猪IgG购自Solarbio公司。

1.3 病料总RNA的提取猪瘟病料中的总RNA采用TaKaRa公司生产的RNAiso Plus试剂提取。组织RNA的提取及cDNA的合成参照文献[21]进行。

1.4 CSFVE0基因的扩增及重组质粒的构建根据猪瘟病毒的核苷酸序列，设计扩增猪瘟病毒E0基因的引物如下：CSFV-E0-S:5′-CCGGAATTCCTCAGAGGGGTCAATAGGAGC- 3′； CSFV-E0-AS:5′-CCGCTCGAGGTAGGCACCGAACCAGGTTTTG- 3′。将RT-PCR扩增的目的片段进行双酶切后，分别克隆到pGEX-4T-1和pET-28a载体的EcoRⅠ/XhoⅠ酶切位点上。连接产物转化到TOP10感受态中，挑取单菌落、培养与提取质粒进行双酶切鉴定。

1.5 重组蛋白的表达与纯化将pGEX-4T-1-E0和pET-28a-E0重组质粒转入BL21感受态中，挑取单菌落，培养细菌D600至0.6～0.8后，加入1 mmol/L的IPTG 37℃诱导3 h后收集菌体，进行SDS-PAGE分析。GST-E0重组蛋白纯化参照文献[22]方法进行，即将表达蛋白的菌以上述方法大量诱导，收集的菌体超声破碎后，以10 000 r/min离心15 min，包涵体沉淀用1.5 mol/L尿素反复洗后，溶解到8 mol/L尿素中。

1.6 重组蛋白的免疫学鉴定纯化蛋白以SDS-PAGE电泳后，转膜至PVDF膜，并以5%的脱脂奶粉封闭1 h。以PBST洗涤后，加入稀释的阳性血清，室温孵育1 h 后,加入HRP标记的山羊抗猪IgG二抗，室温孵育45 min,以同样方法洗涤后，加入ECL发光液显色。

1.7 抗原最佳包被量与血清最佳稀释度的确定采用方阵滴定法进行。将纯化的GST-E0和His-E0重组蛋白按照25,50,100,200,400 ng/孔包被酶标板，4℃放置过夜；以0.01 mmol/L PBS洗涤液(pH7.2,含有0.05%Tween-20)洗板3次，加入5%的脱脂奶粉37℃封闭1 h；再用PBS-T洗涤3次后分别加入20，40，80，160，320，640，1 280倍稀释的阳性和阴性血清，37℃孵育1 h。再次洗涤后，加入1∶5 000倍稀释的HRP 标记的羊抗猪的二抗，37℃孵育45 min。PBS-T洗涤3次后加入OPD显色试剂，每孔100 μL。室温避光显色15 min，加入2 mol/L H2SO4100 μL终止反应，测定D490值。

1.9 特异性试验以建立的间接ELISA方法对PRRSV、PCV2、PEDV、PRV感染的阳性血清样品进行检测，同时用猪瘟阳性血清和阴性血清做对照，确定检测猪瘟血清抗体的间接ELISA方法的特异性。

1.10 重复性试验应用3份猪瘟阳性血清和3份阴性确定试验的板间和板内重复性。根据测定的D490值，计算标准差与差异系数。

1.11 敏感性试验将猪瘟阳性血清样品用PBS按照1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，1∶1 280进行倍比稀释，然后以GST-E0和His-E0重组蛋白建立的间接ELISA方法进行检测，确定该方法的敏感性。

1.12 间接ELISA方法与IDEXX试剂盒的平行比较试验以GST-E0、His-E0间接ELISA和IDEXX E2试剂盒平行检测88份临床血清样品，分别确定2种ELISA方法与IDEXX E2试剂盒的符合率。

1.13 本试验建立的间接ELISA和IDEXX试剂盒分别与间接免疫荧光(IFA)的符合率以猪瘟病毒疫苗C株和CSFV野毒株感染的细胞为抗原，应用IFA试验，分别检测His-E0 ELISA方法和IDEXX E2试剂盒检出的阴性和阳性样品，确证His-E0 ELISA方法和IDEXX E2试剂盒方法的检测结果。同时设置未接毒细胞为空白对照。

1.14 间接ELISA方法的初步应用以His-E0建立的间接ELISA方法检测采自某地区猪瘟疫苗免疫的5个种猪群的血清E0抗体，每个猪群样品数量为20头份，确定猪瘟E0抗体的阳性率。

2 结果

2.1 CSFVE0基因的扩增如图1所示，应用RT-PCR方法，扩增出预期大小为615 bp 的E0基因片段。

2.2 重组质粒的构建与酶切鉴定如图2所示，重组质粒以XhoⅠ或EcoRⅠ进行单酶切和双酶切进行鉴定，得到预期大小的片段，表明重组质粒构建成功。

2.3 重组蛋白的表达与纯化将重组质粒转化到BL21中进行诱导表达，表达产物的SDS-PAGE电泳结果如图3所示，诱导菌成功表达目的蛋白，GST-E0大小为48 000，His-E0大小为23 000。

2.4 重组E0蛋白的Western blot鉴定如图4所示，Western blot鉴定GST-E0和His-E0重组蛋白与猪瘟阳性血清均发生特异性反应。

2.5 最佳抗原包被量与血清最佳稀释度的确定方阵滴定法确定出GST-E0抗原和His-E0抗原的最佳包被量分别为50 ng/孔和100 ng/孔，血清最佳稀释度为160倍(表1,2)。

2.6 间接ELISA方法的判定标准以GST-E0和His-E0重组蛋白建立的间接ELISA方法分别检测80份阴性血清，测得D490值后，计算出平均值、标准差和临界值。结果如表3所示，以GST-E0重组蛋白为包被抗原，被检测样品D490≥0.167时判定为阳性，否则判定为阴性；以His-E0重组蛋白为包被抗原，被检测样品D490≥0.176时判定为阳性，否则判定为阴性。

图1 PCR产物凝胶电泳 M.DL2000 DNA Marker;1.E0基因PCR产物

图2 重组质粒pGEX-4T-1-E0酶切鉴定(A)及重组质粒pET-28a-E0酶切鉴定(B) M.DL5000 DNA Marker;1.重组质粒XhoⅠ单酶切;2.重组质粒EcoRⅠ单酶切;3.重组质粒双酶切;4.质粒对照

图3 重组蛋白表达与纯化 M.低分子量蛋白Marker;A.GST-E0重组蛋白表达与纯化;A1.IPTG未诱导细菌表达产物;A2.IPTG诱导细菌表达产物;A3.纯化后的包涵体沉淀;B.His-E0重组蛋白表达与纯化;B1.IPTG未诱导细菌表达产物;B2.IPTG诱导细菌表达产物;B3.纯化后的重组蛋白

图4 Western blot鉴定重组蛋白抗原性 M.蛋白Marker;A1.纯化的GST-E0重组蛋白；B1.纯化的His-E0重组蛋白

表1 GST-E0重组蛋白最佳包被量与血清最佳稀释度的确定(D490值)

表2 His-E0重组蛋白最佳包被量最佳包被量与血清最佳稀释度的确定(D490值)

表3 间接ELISA方法临界值的确定

2.7 敏感性试验将阳性血清进行20、40、80、160、320、640、1 280倍稀释后采用本试验建立的间接ELISA方法进行检测。结果当血清样品稀释640倍时，检测结果都仍为阳性，表明所建立的猪瘟血清抗体间接ELISA方法具有较好的敏感性。

2.8 特异性试验以GST-E0和His-E0重组蛋白建立的间接ELISA方法分别检测PRV、PEDV、PCV2、PRRSV、CSFV的阳性血清，结果只有猪瘟阳性血清检测为阳性，而PRV、PEDV、PCV2、PRRSV感染后的阳性血清检测为阴性，表明所建立的间接ELISA方法均具有良好的特异性。

2.9 重复性试验

2.9.1GST-E0重组蛋白的间接ELISA方法重复性试验 以GST-E0重组蛋白建立的间接ELISA方法检测3份阳性血清和3份阴性血清，根据测的D490值分别计算板间和板内平均值、标准差和变异系数，结果见表4和表5，阳性血清和阴性血清的板间变异系数(CV)为1.72%～4.22%，板内重复系数为1.25%～8.75%，说明该方法具有较好的重复性。

表4 GST-E0重组蛋白的间接ELISA方法板内重复性试验结果

注：1、2、3为阳性血清样品，4、5、6为阴性血清样品。下同

表5 GST-E0重组蛋白的间接ELISA方法板间重复性试验结果

2.9.2His-E0重组蛋白的间接ELISA方法重复性试验 以His-E0重组蛋白建立的间接ELISA方法检测3份阳性血清和3份阴性血清，根据测的D490值分别计算板间和板内平均值、标准差和变异系数，结果见表6和表7，阳性血清和阴性血清的板间变异系数(CV)为1.05%～5.44%，板内重复系数为0.71%～3.06%，说明该方法具有较好的重复性。

2.10 间接ELISA与IDEXX试剂盒检测结果的比较

2.10.1基于GST-E0重组蛋白的间接ELISA方法与IDEXX E2 血清抗体检测比较结果 以GST-E0重组蛋白建立的间接ELISA方法和IDEXX E2试剂盒平行检测88份猪血清样品，结果见表8。ELISA方法检测出61份阳性样品，27份阴性样品，而IDEXX E2试剂盒检测出66份阳性样品，22份阴性样品，两者符合率为78.41%。

2.10.2基于His-E0重组蛋白的间接ELISA方法与IDEXX E2 血清抗体检测比较结果 以His-E0重组蛋白建立的间接ELISA方法与IDEXX E2试剂盒平行检测88份猪血清样品，结果见表9。间接ELISA方法检测出68份阳性样品，20份阴性样品；而IDEXX E2 试剂盒检测出66份阳性样品，22份阴性样品，两者总符合率为84.09%。符合率结果高于2.10.1中的结果，表明基于His-E0的间接ELISA敏感性高于基于GST-E0的间接ELISA方法。

表6 His-E0重组蛋白的间接ELISA方法板内重复性试验结果

表7 His-E0重组蛋白的间接ELISA方法板间重复性试验结果

表8 基于GST-E0重组蛋白的间接ELISA方法与IDEXX E2 抗体检测试剂盒比较试验结果

表9 基于His-E0重组蛋白的间接ELISA方法与IDEXX E2 试剂盒比较试验结果

2.11 基于His-E0的间接ELISA和IDEXX试剂盒与间接免疫荧光(IFA)比较试验结果为进一步确证本试验建立的间接ELISA方法的准确性，选择His-E0的间接ELISA方法与IFA试验进行比较，比较结果见表10和表11。在88份血清样品中，IFA检测出74份阳性血清，14份阴性血清；间接ELISA方法检测出68份阳性样品，20份阴性样品，2种方法的总符合率为93.18%。而应用IDEXX E2试剂盒检测的上述88份样品中，66份为阳性，22份为阴性，2种方法的检测结果符合率为90.91%，表明His-E0间接ELISA方法敏感性稍微高于IDEXX检测试剂盒。 此外，应用IFA对间接ELISA与IDEXX检测的差异样品进行了鉴定。结果如图5A所示，以His-E0的间接ELISA检测为阳性而IDEXX试剂盒检测为阴性的血清进行IFA，结果样品与接毒细胞反应后呈现绿色荧光，表明这部分血清为猪瘟阳性血清；图5B所示，His-E0间接ELISA检测为阴性而IDEXX试剂盒检测为阳性的血清进行IFA检测，结果也存在绿色荧光出现，表明本试验建立的间接ELISA方法与IDEXX试剂盒检测结果中都存在部分的假阴性结果。

表10 基于His-E0重组蛋白的间接ELISA方法与间接免疫荧光(IFA)比较试验结果

表11 IDEXX试剂盒与间接免疫荧光(IFA)比较试验结果

图5 间接免疫荧光检测结果 A～D.接种猪瘟阳性病毒液；E～H.未接毒的正常细胞；A、E.以间接ELISA检测为阳性IDEXX试剂盒检测为阴性的血清样品；B、F.以间接ELISA检测为阴性IDEXX试剂盒检测为阳性的血清样品；C、G.用猪瘟阳性血清做一抗检测；D、H.用猪瘟阴性血清做一抗检测

2.12 某地区不同种猪群中猪瘟E0抗体的检测结果以建立的His-E0间接ELISA方法对江苏省某地区猪瘟疫苗免疫的5个种猪群进行检测，结果检测的5个种猪群中，4个种猪群的E0抗体阳性率为100%，1个种猪群的E0抗体阳性率只有50%，表明本试验建立的间接ELISA方法也可用于猪瘟E2疫苗免疫猪群的免疫效果确定。

3 讨论

本试验应用RT-PCR方法扩增猪瘟E0蛋白基因，并将其克隆到pGEX-4T-1与pET-28a原核表达载体进行重组蛋白的表达。应用表达纯化的重组蛋白作为包被抗原，建立了检测猪瘟病毒E0抗体的间接ELISA方法。特异性、敏感性和重复性试验的结果表明，建立的检测E0抗体ELISA方法与IDEXX 公司检测E2抗体的试剂盒具有较好的符合率，符合率可以达到78.41%～84.09%。同时,进行了以猪瘟病毒接毒细胞为抗原的IFA试验，确定了His-E0 ELISA方法和IDEXX E2 试剂盒检测结果的差异样品的准确性，结果发现建立的His-E0 ELISA方法与IDEXX E2试剂盒具有相似的准确性，可用于鉴别E2蛋白免疫猪群中的猪瘟野毒感染。

检测抗体的包被抗原是建立间接ELISA方法的关键。本试验分别用GST-E0和His-E0的蛋白建立了ELISA方法，研究结果显示，与IDEXX E2试剂盒比较，His-E0 作为包被抗原建立的ELISA比GST-E0抗原建立的ELISA方法具有更高的符合率。本试验纯化包涵体形式的蛋白参照先前介绍的方法[22]，包涵体以1.5 mol/L 的尿素反复洗3次后，除去大量的杂蛋白，最终将目的蛋白溶解到8 mol/L 的尿素中。本试验结果显示，基于GST-E0和His-E0重组蛋白作为包被抗原所建立的间接ELISA方法两者在敏感性，特异性及重复性上没有明显差异。 GST-E0和His-E0 ELISA方法与IDEXX E2试剂盒的比对结果显示，它们的符合率分别为78.41%和84.09%。同时，His-E0重组蛋白为包被抗原的间接ELISA与IDEXX试剂盒的符合率更高，说明不同表达系统表达同一抗原存在差异，对样品的检测结果有一定的影响，其原因可能是His-E0重组蛋白带有的His标签对E0蛋白结构影响小，有利于E0蛋白抗体检测。吴素丽等[12]利用pET-32原核表达系统建立的猪瘟E0血清抗体间接ELISA与IDEXX试剂盒的符合率为83%，张平[23]利用的毕氏酵母表达系统建立的猪瘟E0血清抗体间接ELISA与IDEXX试剂盒的符合率为80.2%，都明显低于本试验利用pET-28a原核表达系统建立的间接ELISA与IDEXX的符合率，说明本试验所选取的表达系统表达出的重组蛋白对于猪瘟E0抗体的检测更敏感，也可能本试验所选取的E0抗原区的抗原性更好。为进一步验证本试验建立的间接ELISA更敏感，本试验应用了间接免疫荧光试验对88份血清进行检测，并分别与基于His-E0的间接ELISA方法和IDEXX试剂盒检测结果进行比较，符合率分别为93.18%和90.91%。基于His-E0的间接ELISA方法的敏感性明显高于IDEXX试剂盒。从间接免疫荧光检测的结果中还发现试剂盒检测为阳性而本试验所建立的方法检测为阴性，但经过间接免疫荧光检测为阳性，原因可能是两者的判定标准上以及血清稀释倍数上存在差异，且不同猪体内的抗体水平上也存在差异，有的血清样品本身为弱阳性，在经过160倍稀释后便成为了阴性。而对于本试验建立的间接ELISA在试剂盒检测的阴性血清中检测到的阳性样品，间接免疫荧光试验鉴定后为阳性，表明IDEXX试剂盒与本试验建立的ELISA方法检测结果中都存在一些假阴性结果，因此在临床样品检测中应给予相应的关注。