塞尼卡病毒VP1与VP3蛋白原核表达及蛋白纯化

张金勇，张 赫，孙文超，肖朋朋，南福龙,4，韩继成，解长占，哈 卓，庄忻雨，许 汪，鲁会军*，金宁一*

(1.吉林农业大学 动物科技学院，吉林 长春 130118；2.军事科学院 军事兽医研究所，吉林 长春 130122；3.温州大学 病毒学研究所，浙江 温州 325035；4.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062)

塞尼卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)也被称为A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)，该病毒最早由美国的研究人员从污染的人胚胎视网膜细胞(PER.C6)中分离出来，命名SVV-001[1]。SVV可作为一种溶瘤候选药物进行研发，SVV-001治疗小细胞肺癌(small-cell lung cancer,SCLC)已经完成了临床Ⅰ期研究[2]。

2007年，加拿大首次报道猪感染SVV，随后在美国部分猪场检测到SVV[3]。近年来，SVV在美国、巴西、加拿大、泰国、哥伦比亚、越南等国家小范围流行[4-8]；我国于2015年在广东省某猪场首次确诊猪群感染SVV，并分离CH-01-2015病毒毒株[9-10]，随后陆续在湖北、黑龙江、福建、河南、甘肃等省份检测并分离出SVV病毒毒株[7,11]；研究人员对我国2016-2018年的部分省份进行回顾性研究发现，辽宁、山东、云南、湖南、新疆、湖北、广西、四川、贵州、上海等多个省份均出现猪群感染SVV[7]。塞尼卡病毒病临床症状与猪口蹄疫、猪水疱病、猪水疱疹病以及水疱性口炎临床症状极为相似；急性主要表现为鼻镜、口腔、舌、蹄冠部等部位出现皮肤或者黏膜出现水疱，轻者表现为发热、嗜睡、厌食等临床症状，临床症状可持续2～14 d[12-14]；此外，5日龄以内新生仔猪对该病毒较为敏感，病死率可达70%[6,15]。

SVV属于小RNA病毒科塞尼卡病毒属的唯一成员；该病毒为单股正链RNA病毒，基因组全长约7.3 kb，由5′非编码区域(untranslated region,UTR)、1个开放阅读框(open reading frame,ORF)、3′非编码区域(untranslated region,UTR)以及poly尾巴组成，构成小RNA病毒科L-4-3-4标准结构布局[1,16]。其中，SVV的开放阅读框(长度约2 180个氨基酸)在自身蛋白酶的作用下可以裂解为前导蛋白L以及P1、P2、P3。P1主要编码病毒衣壳结构蛋白，在蛋白酶的作用下进一步裂解为VP0、VP3、VP1，成熟的VP0裂解为VP2与VP4；P2与P3编码与病毒复制的相关蛋白，在蛋白酶的作用下依次裂解为2A、2B、2C、3A、3B、3C以及3D[16-17]。SVV的衣壳结构蛋白较为保守，且含有主要的抗原表位，能够与宿主细胞结合产生特异性免疫应答，其已经作为SVV诊断的主要诊断靶抗原进行研究。

本试验拟通过原核表达系统成功表达并纯化SVV VP1与VP3蛋白，为下一步单克隆抗体与多克隆抗体制备、相关ELISA检测方法以及基因工程相关疫苗等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种、质粒Trans1-T1、E.coliBL21 (DE3)化学感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；原核表达载体pET32a(+)由本实验室保存。

1.2 主要试剂BamHⅠ、XhoⅠ限制性内切酶均购自Thermo Scientific公司； IPTG购自Sigma公司；鼠源His单克隆抗体、HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体购自碧云天公司；DL2000 DNA Marker、T4DNA连接酶、ExTaq PCR酶均购自TaKaRa公司；Blue Plus Marker、His标签镍离子蛋白纯化柱均购于北京全式金公司；DL5000 DNA Marker购自诺唯赞生物科技有限公司。

1.3 引物设计参照SVV CH-01-2015病毒毒株序列(GenBank登陆号：KT321458.1)及本研究所需的酶切位点，设计SVV VP1与VP3引物(表1)，引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.4 目的基因获取与扩增参考SVV CH-01-2015病毒毒株序列(GenBank登录号：KT321458.1)，将VP1与VP3基因片段交由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以获取的SVV cDNA为模板扩增VP1与VP3片段。PCR反应体系为25 μL体系：在PCR管中依次加入ddH2O 13.75 μL， 10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mixture 2.5 μL、10 μmol/L上游引物、下游引物各1 μL ，模板4 μL、Ex Taq酶 0.25 μL；SVV VP1与VP3基因的扩增条件为：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段备用。

表1 扩增SVV VP1与VP3所需引物

注：下划线部分为酶切位点，括号内为酶切位点名称

1.5 重组表达质粒pET32a-VP1与pET32a-VP3的构建使用BamHⅠ/XhoⅠ分别双酶切VP1片段、VP3片段以及pET32a质粒，纯化回收目的片段。分别将VP1与VP3连接至pET32a目的载体，对获得的质粒分别命名为pET32a-VP1、pET32a-VP3，并进行双酶切鉴定，鉴定正确的质粒送往吉林省库美生物科技有限公司进行测序。将鉴定正确的pET32a-VP1、pET32a-VP3转化至E.coliBL21(DE3) 感受态，挑取单克隆菌落，震荡培养12～14 h 后，保存菌液并提取质粒鉴定。

1.6 VP1与VP3重组蛋白诱导表达复苏保存的pET32a-VP1、pET32a-VP3重组菌液，37℃、200 r/min振荡培养至菌液D600为0.4～0.6时，加入IPTG进行诱导表达，收集菌液超声处理后，以10%的分离胶进行SDS-PAGE试验。

1.7 Western blot试验使用1.6蛋白样品，以10%的分离胶进行SDS-PAGE，将蛋白转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂乳封闭2 h，鼠源His抗体孵育过夜，TBST洗涤3次，5 min/次，使用HRP标记的山羊抗小鼠二抗室温孵育40 min，TBST洗涤3次后，5 min/次，显影。

1.8 VP1与VP3重组蛋白表达形式分析复苏保存的pET32a-VP1、pET32a-VP3重组菌(参照1.6方法)，加入IPTG进行诱导表达，收取菌液，经超声破碎后，5 000 r/min离心10 min，收取上清，取适量的PBS重悬沉淀，分别取上清、细菌包涵体制备样品，用10%的分离胶进行SDS-PAGE试验。

1.9 VP1与VP3重组蛋白表达条件优化

1.9.1时间条件优化 向试管中加入等量的VP1或VP3重组菌，37℃、200 r/min振荡培养至菌液D600为0.4～0.6时，加入等量的IPTG进行诱导。分别于诱导0，1，2，3，4，5，6，7，8 h取等量的菌液，制备蛋白样品，以10%分离胶进行SDS-PAGE试验，分析诱导表达的最佳时间。

1.9.2诱导剂浓度优化 向试管中加入等量的SVV VP1或VP3表达菌，37℃、200 r/min振荡培养至菌液D600为0.4～0.6时，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L的IPTG诱导剂，诱导5 h后，收集菌液，制备蛋白样品，用10%分离胶进行SDS-PAGE试验，分析最佳诱导剂浓度。

1.9.3诱导温度优化 向试管中加入等量的VP1或VP3重组菌，振荡培养至菌液D600为0.4～0.6时，加入0.6 mmol/L的IPTG诱导剂，分别置于25，37℃诱导5 h，收集菌液，制备蛋白样品，用10%分离胶进行SDS-PAGE试验，分析最佳诱导温度。

1.10 SVV VP1与VP3蛋白纯化复苏VP1或VP3重组菌，转移至300 mL培养基中，于37℃条件下震荡培养至菌液D600为0.4～0.6时，加入0.6 mmol/L 的IPTG诱导剂，培养5 h，收集蛋白。参照说明书利用Ni2+-NTA金属螯合蛋白质纯化柱进行纯化，制备蛋白样品，用10%分离胶进行SDS-PAGE试验，分析蛋白纯化效果。

2 结果

2.1 SVV VP1与VP3基因扩增利用VP1与VP3引物分别扩增出约792，717 bp的产物，与预期大小一致(图1)。

图1 SVV VP1(A)与VP3(B)基因扩增结果 M.DL2000 DNA Marker；A1：VP1 PCR产物；A2.阴性对照;B1.VP3 PCR产物；B2.阴性对照

2.2 重组表达质粒pET32a-VP1与pET32a-VP3的构建及鉴定将SVV VP1与VP3基因片段克隆至pET32a载体，获取质粒后，经BamHⅠ/XhoⅠ分别双酶切pET32a-VP1与pET32a-VP3进行鉴定，VP1与VP3基因片段成功克隆至pET32a载体(图2)。

图2 重组质粒pET32a-VP1(A)与pET32a-VP3(B)酶切鉴定 M1.DL5000 DNA Marker；M2.DL2000 DNA Marker；A1.pET32a-VP1重组质粒；A2.pET32a-VP1质粒酶切产物；B1.pET32a-VP3重组质粒；B2.pET32a-VP3质粒酶切产物

2.3 VP1与VP3重组蛋白诱导表达收取诱导后的菌液，SDS-PAGE试验结果表明pET32a-VP1重组菌经诱导后在约50 000处有明显条带，pET32a-VP3重组菌经诱导后在约48 000处有明显条带(图3)；Western blot试验结果表明2种重组菌均可见单一目的条带(图4)。

2.4 VP1与VP3重组蛋白表达形式分析分别收取pET32a-VP1与pET32a-VP3重组菌，分别获取破碎细菌后的上清与包涵体， SDS-PAGE结果表明，2种重组菌均以包涵体的形式表达蛋白(图5)。

图3 SVV VP1蛋白(A)与VP3蛋白(B)表达SDS-PAGE验证 M.Blue Plus蛋白Marker；A1.pET32a空载蛋白；A2：pET32a-VP1蛋白；B1.pET32a空载蛋白;B2.pET32a-VP3蛋白

图4 SVV VP1蛋白(A)与VP3蛋白(B)表达Western blot验证结果 M.Blue Plus蛋白Marker；A1.pET32a-VP1；A2.pET32a空载体；B1.pET32a-VP3;B2.pET32a空载

图5 SVV VP1蛋白(A)与VP3蛋白(B)表达形式验证结果 M.Blue Plus蛋白Marker；A1.pET32a-VP1重组菌上清；A2.pET32a-VP1重组菌包涵体； B1.pET32a-VP3重组菌上清；B2.pET32a-VP3重组菌包涵体

2.5 VP1与VP3重组蛋白表达条件优化

2.5.1优化诱导时间 于诱导后0、1、2、3、4、5、6、7、8 h取等量的菌液，制备蛋白样品，进行SDS-PAGE试验，结果表明：pET32a-VP1与pET32a-VP3重组菌均在诱导5 h后表达量最高(图6)。

2.5.2优化诱导剂浓度 向等量重组菌加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L IPTG诱导剂，SDS-PAGE试验结果表明pET32a-VP1与pET32a-VP3重组菌均在诱导剂浓度大于等于0.6 mmol/L时表达量最高(图7)。

2.5.3优化诱导温度 将重组菌分别置于25,37℃诱导5 h， SDS-PAGE试验结果表明pET32a-VP1与pET32a-VP3重组菌均在37℃表达量较高(图8)。

图6 SVV VP1蛋白(A)与VP3蛋白(B)诱导表达时间分析结果 M.Blue Plus蛋白Marker；A1～A9,B1～B9.诱导时间分别为0，1，2，3，4，5，6，7，8 h

图7 SVV VP1蛋白(A)与VP3蛋白(B)诱导剂浓度分析结果 M.Blue Plus蛋白Marker；A1～A6,B1～B6.诱导浓度分别为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L

图8 SVV VP1蛋白(A)与VP3蛋白(B)诱导剂温度分析结果 M.Blue Plus蛋白Marker；A1.37℃诱导pET32a-VP1重组菌；A2.25℃诱导pET32a-VP1重组菌；B1.37℃诱导pET32a-VP3重组菌；B2.25℃诱导pET32a-VP3重组菌

2.6 VP1与VP3重组蛋白纯化大量培养pET32a-VP1与pET32a-VP1重组菌，收集蛋白样品，参照Ni2+-NTA金属螯合蛋白质纯化柱说明书对蛋白进行纯化，结果表明成功纯化VP1与VP3重组蛋白(图9)。

图9 SVV VP1蛋白(A)与VP3蛋白(B)蛋白纯化分析结果 M.Blue Plus蛋白Marker；A1.pET32a-VP1重组菌蛋白纯化后；A2.pET32a-VP1重组菌蛋白纯化前；B1.pET32a-VP3重组菌蛋白纯化后；B2.pET32a-VP3重组菌蛋白纯化前

3 讨论

自2007年首次于加拿大猪群分离到该病毒株以来，全球已经有多个国家相继报道SVV感染猪群的病例[7]。2015年以来，多个国家相继报道SVV流行与小范围暴发，作为一种新发传染病，已经造成了巨大的经济损失。研究表明，SVV在感染的猪群中可存在7～21 d，临床症状持续12～14 d，病毒血症持续1～10 d[18]。SVV与其他猪原发性水疱病症状基本类似，临床上很难诊断。截止目前为止，尚未见研究证实SVV存活的环境以及其传播方式的报道；然而，研究人员在小鼠肠道以及粪便中、家蝇中均检测到SVV，表明这些物种可能会携带病原进行传播[19]。我国自2015年首次发现并分离SVV毒株以来，已经有多个省份报道检测到SVV；研究人员对2016-2018年的部分省份样品进行回顾性检测，发现我国的部分省份早在2016年即已经存在SVV感染猪群[7]。

研究人员使用pET24b系统表达SVV VP1、VP2、VP3蛋白，并建立间接ELISA方法，研究显示使用VP2蛋白包被建立的ELISA方法优于VP1与VP3蛋白包被建立的ELISA方法[20]。SVV VP1、VP3蛋白含有多个抗原表位，是新型疫苗研发的首选蛋白区域[21]，尚未见研究利用SVV VP1、VP3表达的蛋白建立中和等检测方法的报道。本试验将SVV VP1与VP3的基因片段克隆至pET32a(+)载体，利用大肠杆菌表达系统对SVV VP1与VP3区域蛋白进行表达，结果显示分别以包涵体的形式表达出约50 000,48 000的重组蛋白；并对两者的表达条件进行优化。利用Ni2+-NTA金属螯合蛋白质纯化柱对原核表达系统表达的SVV VP1与VP3蛋白进行纯化，成功纯化出SVV VP1与VP3蛋白。SVV VP1与VP3蛋白的表达与纯化，为下一步研究SVV单克隆及多克隆抗体的制备、新型疫苗研发及血清学检测方法等奠定基础。