黄瓜蜡质合成相关基因CsCER4的克隆与表达分析

宫思宇，于 越，郭冬雪，杜亚琳，郝 宁，武 涛,

(1.东北农业大学 园艺园林学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.湖南农业大学 园艺园林学院，湖南 长沙 410128)

植物为了适应干燥、高温、紫外线等恶劣的环境条件，器官表面进化出角质层。角质层可以限制非气孔水分流失并限制灰尘沉积在植物表面上，角质层也可以保护植物免受各种生物和非生物胁迫，如害虫、病原体、紫外线辐射、有毒气体、机械破裂等,植物表皮角质层的2个主要成分为蜡质和角质[1]。

目前，植物蜡质合成调控研究取得了较大进展[2-4]。C16和C18脂肪酸在细胞质体中从头合成，在酰基-ACP硫解酶作用下被ACP释放，在酰基辅酶A合成酶(LACSs)的作用下，转化为脂肪酰辅酶A运输到内质网。在内质网上，脂肪酰辅酶A在脂肪酸延伸复合体(FAE)的催化循环作用下形成碳链长C24—C36的长链脂肪酸VLCFAs，FAE是由1个缩合酶、2个还原酶、1个脱水酶组成的，在内质网膜上行使功能[2-3]。VLCFAs是蜡质合成的前体物质，通过2种途径合成蜡质的主要成分，一种是初级醇途径，VLCFAs在脂酰辅酶A还原酶(FAR)的作用下还原为初级醇，接着由蜡质合成酶WSD催化，形成烷基质；另一种是烷烃途径，VLCFAs在FAR的催化下，还原成醛，再由醛脱羧酶催化生成烷烃，中链烷烃羟化酶(MAH1)催化烷烃生成二级醇，二级醇在MAH1的作用下生成酮[4]。

拟南芥中已经鉴定多个与表皮蜡质合成相关的基因，如与FAE复合体相关的限速酶基因KCS1、KCS2、KCS6、KCS9、KCS20和KCR1[5-10]，参与蜡质生物合成的细胞色素P450酶(CYP96A15)基因[11]，修饰FAR的CER3和WSD1基因[12-13]。研究表明，CER4是编码FAR的一个典型基因，其参与了气生组织表皮蜡质中伯醇的形成，在幼根和老根中的表达量都很低，暗示CER4在表皮蜡质C24—C30链的形成过程中发挥调控作用[14-15]。

除了拟南芥之外，人们在农作物和园艺作物蜡质合成研究方面也取得了较大进展[16-28]。GAN等[16]利用日本晴水稻为试验材料，鉴定出蜡质代谢合成基因Loc_Os04g40730和Loc_Os03g12030；PU等[25]将甘蓝型油菜中的BnaA.GL基因精确定位到接近染色体A9末端的连锁群。黄瓜是我国设施栽培的主要蔬菜作物之一，表皮蜡质是黄瓜表面最外层的保护物质，为黄瓜的一种重要的综合抗性指标[29]。但到目前为止，对黄瓜表皮蜡质的形成调控还知之甚少。目前只有王文娇[30]克隆了黄瓜蜡质合成的2个基因CsCER1和CsWax2，研究表明，黄瓜中这2个基因表达量异常，影响了黄瓜表皮蜡质含量。鉴于拟南芥中CER4基因在蜡质形成过程中主要参与初级醇途径，对蜡质的产生不可或缺，因此，为了研究黄瓜蜡质合成调控分子机制，克隆了拟南芥CER4基因在黄瓜中的同源基因，命名为CsCER4。通过分析CsCER4基因结构、启动子和基因的表达模式，初步预测CsCER4在调控黄瓜表皮蜡质形成中的作用，为进一步研究其对黄瓜表皮蜡质的调控机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

试验材料为华南型黄瓜649。2018年5月1日在东北农业大学向阳农场大棚直接播种，常规管理。分别取叶片 (最顶部幼嫩叶片)、子房(开花当天)、果皮(开花当天)、茎(距顶端茎尖下第3个节间部分)和雄花(开花前1 d)，用液氮冷冻并于-80 ℃保存，备用。

1.2 CsCER4的克隆、测序及生物信息学分析

在拟南芥数据库(https://www.arabidopsis.org/)中，检索出拟南芥CER4蛋白(AT4G33790)的氨基酸序列，在黄瓜基因组数据库(http://cucurbitgenomics.org/)中进行BLAST比对，选蛋白质序列相似性得分最高的蛋白质，命名为CsCER4，并以该蛋白质编码基因(Csa6G151800.1)的cDNA序列为模板设计引物(上游引物：5′-ATGGTGGTAAATATGATTATCATG-3′，下游引物：5′-TCATTTGAAGATGTGTTTAACTAGT-3′)用于基因克隆。提取黄瓜叶片的总RNA(康为世纪 CWBIO OmniPlant RNA Kit)，将RNA反转录为cDNA(康为世纪HiFiScript cDNA Synthesis Kit)，将得到的cDNA作为模板进行CsCER4克隆。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，51.6 ℃复性30 s，72 ℃延伸60 s，34个循环；72 ℃10 min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，进行回收、纯化(DNA 凝胶回收试剂盒，天根)，送擎科生物工程(哈尔滨)股份有限公司测序。利用在线软件对CsCER4的等电点(pI)、二级结构及跨膜区域等进行分析。

1.3 CsCER4同源蛋白序列比对和系统发育树的构建

在美国国立生物技术信息中心数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，使用BLAST程序搜索与CsCER4蛋白同源性高的植物蛋白序列。使用DNAMAN软件将CsCER4蛋白序列和其他同源性高的植物蛋白序列用邻近相连法构建系统发育树。

1.4 CsCER4表达模式分析

提取649黄瓜的子房、果皮、叶片、茎、雄花等组织的RNA。将RNA反转录为cDNA(康为世纪 HiFiScript cDNA Synthesis Kit)，每个样本设计3次生物学重复。以CsCER4基因序列为模板设计引物(上游引物：5′-TCAAGCGGCCGTGTTAATGAGC-3′，下游引物：5′-CGTTTGGCTCATCGGAAAGTTGG-3′)用于表达模式分析。使用 iCycler iQTM5 real-time PCR检测系统(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)、SYBR-Green试剂盒(Toyobo)进行qRT-PCR。以黄瓜CsActin基因(上游引物：5′-CGCTCTTCTTGCTTTCACCCTT-3′，下游引物：5′-TACCTTGCCTTGGAGTATTTGG-3′)为内参。反应条件同1.2。每个样品重复3次。

1.5 CsCER4启动子元件分析

在黄瓜基因组数据库(http://cucurbitgenomics.org/)搜索CsCER4的启动子序列，利用在线分析软件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对CsCER4启动子区域所含的转录调控元件进行分析。

2 结果与分析

2.1 CsCER4的克隆及序列分析

序列比对结果显示，在黄瓜基因组中与拟南芥CER4蛋白氨基酸序列相似性最高的基因为Csa6G151800.1，序列相似性为46.07%，将其编码基因命名为CsCER4。CsCER4基因属于FAR家族。通过对PCR扩增产物的测序，获得黄瓜649中CsCER4的cDNA编码区序列。CsCER4基因CDS全长540 bp，包含3个外显子、2个内含子，编码179个氨基酸(图 1)。生物信息学分析结果表明，CsCER4等电点(pI)为9.79，是碱性蛋白质。CsCER4亲水性为-0.349,不通过跨膜区，在膜外进行作用。蛋白质氨基酸序列以α-螺旋(48.6%)和无规则卷曲(30.73%)为主，延伸链(15.64%)和β-转角(5.03%)为辅。

2.2 CsCER4系统发育进化分析

通过美国国立生物技术信息中心数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，利用BLAST检索CsCER4在不同植物中的同源蛋白，从检索结果中选取了来自16个不同物种的16个同源性高的蛋白质序列：甜瓜(Cucumismelo)、南瓜(Cucurbitamoschata)、西葫芦(Cucurbitapepo)、苦瓜(Momordicacharantia)、番木瓜(Caricapapaya)、山黄麻(Tremaorientale)、花生(Arachishypogaea)、大豆(Glycinemax)、木豆(Cajanuscajan)、豇豆(Vignaunguiculata)、苜蓿(Medicagotruncatula)、棉花(Gossypiumraimondii)、海岛棉(Gossypiumbarbadense)、石榴(Punicagranatum)、川桑(Morusnotabilis)、红车轴草(Trifoliumpratense)。通过系统发育进化分析发现，黄瓜CsCER4与同为葫芦科的甜瓜(Cucumismelo)、苦瓜(Momordicacharantia)、南瓜(Cucurbitamoschata)、西葫芦(Cucurbitapepo)的CER4 蛋白亲缘关系较近(图2)，但目前还没有生物学功能鉴定相关的报道。

图2 CsCER4进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of CsCER4 in cucumber and its homologs

2.3 CsCER4表达模式分析

qRT-PCR分析结果表明，CsCER4基因在不同组织部位均有表达，在子房中CsCER4基因的表达量极显著高于其他组织，在果皮、叶片和雄花中的表达量次之，而在茎中的表达量最低(P<0.01，图3)，表明该基因的表达存在组织特异性。

2.4 CsCER4启动子元件分析

利用启动子在线分析软件PLANTCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对CsCER4基因的启动子调控元件进行分析。取长约2 000 bp的启动子序列进行分析。预测结果显示，在CsCER4启动子序列中鉴定出31个启动子元件(表1)，其中，ABRE、P-box、TCA-element 对脱落酸、赤霉素、水杨酸等激素具有反应；TC-rich repeats、MBS、ARE响应防御、干旱、厌氧等胁迫；TCT-motif等为光响应元件；Unnamed-1和CAAT-box等为启动子和增强子区域中的顺式元件。根据启动子预测结果，推测黄瓜CsCER4基因对激素、逆境胁迫、光等具有响应。CsCER4基因启动子预测结果基本与本试验结果一致，因此推断CsCER4基因可能与黄瓜表皮蜡质合成有关。

不同大写字母表示CsCER4基因在不同组织中表达量差异极显著(P<0.01)The different letters mean that the expression of CsCER4 gene is significantly different among different tissues(P<0.01)图3 黄瓜CsCER4 表达模式分析 Fig.3 Expression analysis of CsCER4 in cucumber

表1 黄瓜CsCER4基因启动子调控元件的分析Tab.1 Analysis of regulatory elements in the promoter of CsCER4 in cucumber

注：+ 表示CsCER4基因启动子正义链中有这个调控元件。

Note: + indicates that this regulatory element is present in the sense strand of theCsCER4gene promoter.

3 结论与讨论

大部分陆生植物的气生器官表面覆盖一层蜡质，蜡质帮助植物抵御干旱、紫外线辐射、病原菌侵染等外界环境胁迫。目前，对拟南芥的蜡质合成途径及作用机制进行了较多研究，但有关黄瓜蜡质合成及其分子调控还知之甚少。本研究克隆了拟南芥中蜡质合成基因CER4在黄瓜中的同源基因CsCER4。CsCER4含有IPR026055结构域，属于脂肪酰基辅酶A还原酶(FAR)家族，其在拟南芥中的同源基因CER4主要参与表皮蜡质合成过程中烷烃形成的初级醇途径，因此，推测CsCER4基因可能也与烷烃形成的初级醇途径有关。CsCER4与同属中甜瓜CER4的同源性最高，进化分析表明，该基因编码的蛋白质与多数植物亲缘关系符合植物进化规律。

植物蜡质一般在植物表皮细胞中合成，蜡质合成基因在表皮中含量最高，本试验qRT-PCR结果中，CsCER4基因在黄瓜子房中表达量最多，其次是果皮，可能是由于开花之前，黄瓜子房进行伸长生长，主要在内果皮和果肉中发生核内复制[31]，因此在子房中表达量最高。

本试验结果表明，CsCER4基因启动子具有启动子常有的相应调控元件以及下游组织特异性表达必需的核苷酸序列，包括TATA-box、CAAT-box等。NOBUSAWA等[32]认为，植物表皮蜡质参与植物激素稳态，CsCER4基因启动子序列中ABRE、P-box、TCA-element 对脱落酸、赤霉素、水杨酸等激素具有响应。CsCER4基因启动子序列中还有响应防御、干旱、氧气以及光照的启动子元件。前人研究结果表明，植物表皮蜡质常常受逆境环境的诱导[33]。在干旱条件下，参与石竹表皮蜡生物合成的3个基因DsCER1、DsMAH1和DsWSD1表达量显著升高[34]。玉米、拟南芥等植物蜡质合成中的关键基因在mRNA水平上的表达受干旱、盐逆境处理调节[35]。在高盐和干旱处理条件下，水稻OsCER4基因表达量均有所上调[36]。CsWax2和CsCER1可以被低温、干旱、盐等非生物胁迫诱导，表达量均呈上升趋势[30]。综上所述，CsCER4基因可能直接参与或通过调控蜡质合成途径影响蜡质的合成，具体机制还需要进一步研究。