烟草病原菌及其生防菌株对烯酰吗啉的敏感性

郭 敬，汤玲玲，赵世民，李淑君，康业斌

(1.河南科技大学 林学院，河南 洛阳 471023； 2.河南省洛阳市烟草公司，河南 洛阳 471023；3.河南省农业科学院 烟草研究所，河南 许昌 461000)

烟草疫霉(Phytophthoranicotianae)、瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、茄病镰刀菌(Fusariumsolani)分别引起烟草黑胫病、猝倒病、立枯病、根腐病，都属于土传病原真菌[1-3]。贺晓辉等[4]采用菌丝生长速率法研究发现，烯酰吗啉对云南省德宏州烟草黑胫病有较好的防控效果。刘畅等[5]在山东烟田土壤中筛选到对山东烟草黑胫病有较强拮抗作用的生防菌株，根据菌株形态和培养特征、ITS序列分析，鉴定该菌株为哈茨木霉(Trichodermaharzianum)；RAO等[6]通过双重培养技术发现，哈茨木霉可以抑制瓜果腐霉的生长；SANTAMARINA等[7]研究表明，哈茨木霉对立枯丝核菌具有较好的拮抗作用。HAN等[8]的研究结果显示，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)对烟草疫霉具有很强的拮抗作用，可以破坏其菌丝结构，引起菌丝畸形、破裂和原生质渗漏；刘丹等[9]综合分析认为，枯草芽孢杆菌可以通过根际定殖竞争、生物膜竞争、抗菌作用、细胞溶解酶作用诱导系统抗病性，抑制烟草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)；蔡璘等[10]研究发现，枯草芽孢杆菌对二孢白粉菌(ErysiphecichoracearumDC.)菌丝生长和分生孢子萌发具有良好的抑制作用。陈倩倩等[11]研究表明，金黄垂直链霉菌(Streptomycesaureoverticillatus)对瓜果腐霉、烟草疫霉、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)具有拮抗作用。尹敬芳等[12]研究表明，烯酰吗啉-枯草芽孢杆菌菌药合剂可以协同防治辣椒疫病(P.capsici)。但在防治烟草病害方面，烯酰吗啉对瓜果腐霉、立枯丝核菌、茄病镰刀菌的抑制作用，以及对生防菌株哈茨木霉、枯草芽孢杆菌、金黄垂直链霉菌的抑制作用均鲜有报道。鉴于此，测定了烟草病原菌烟草疫霉、瓜果腐霉、立枯丝核菌、茄病镰刀菌，以及生防菌株哈茨木霉、枯草芽孢杆菌、金黄垂直链霉菌对烯酰吗啉的敏感性，旨在明确烟草病原菌及其生防菌株对烯酰吗啉的抗药性水平，为烯酰吗啉和哈茨木霉、枯草芽孢杆菌或金黄垂直链霉菌混合施用防治烟草主要土传病原真菌提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

烟草病原菌烟草疫霉、瓜果腐霉、立枯丝核菌、茄病镰刀菌和生防菌株哈茨木霉、枯草芽孢杆菌、金黄垂直链霉菌，均由河南科技大学植物病害分子鉴定与绿色防控实验室提供。98%烯酰吗啉购自上海江莱生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 烯酰吗啉对供试真菌菌丝生长的抑制作用测定 在燕麦(OA)培养基上培养烟草疫霉，在菌落边缘打取直径6 mm的菌饼，菌丝面朝下接种到含烯酰吗啉0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL的OA平板中央，以不含烯酰吗啉的OA平板作为对照；在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上分别培养瓜果腐霉、立枯丝核菌、茄病镰刀菌、哈茨木霉，在菌落边缘打取直径6 mm的菌饼，将瓜果腐霉、立枯丝核菌、茄病镰刀菌接种到含烯酰吗啉0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL的PDA平板中央，哈茨木霉接种到含烯酰吗啉0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL的PDA平板中央，以不含烯酰吗啉的PDA平板作为对照。每组处理设置3个重复。25 ℃恒温培养2～5 d后检查各处理菌丝的生长情况，十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率。比较烯酰吗啉对各病原菌和生防菌的抑制作用，并运用DPS软件建立烯酰吗啉对烟草疫霉的毒力回归方程，计算抑制其菌丝生长的EC50值。

生长抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100%。

1.2.2 烯酰吗啉对供试烟草疫霉孢子囊形成和哈茨木霉分生孢子分化的抑制作用测定 将烟草疫霉接种在含烯酰吗啉0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μg/mL的OA平板上，以不含烯酰吗啉的OA平板为对照，培养5～7 d后，在培养皿内加入质量分数为0.1%的KNO3溶液湿润菌丝，25 ℃恒温培养3 d诱导孢子囊产生，以加入无菌水为对照。在菌落中央打取6个直径为6 mm的菌饼，在10倍光学显微镜下随机选取1个视野观察菌饼上的孢子囊个数，计算抑制率，每个质量浓度设置3个重复。

将烯酰吗啉加入冷却至50 ℃的马铃薯葡萄糖液体(PD)培养基中，配制成0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL的含药培养基(100 mL/250 mL)，以不加烯酰吗啉为对照，加入4块哈茨木霉菌饼，28 ℃、170 r/min培养10 d后，用2层纱布过滤取上清液，通过血球计数板观察分生孢子的个数，计算抑制率。

孢子(囊)抑制率=[对照孢子(囊)个数-处理孢子(囊)个数]/对照孢子(囊)个数×100%。

1.2.3 烯酰吗啉对供试拮抗细菌与放线菌的抑制作用测定 选择牛肉膏蛋白胨(NA)培养基培养枯草芽孢杆菌,选择高氏一号培养基培养金黄垂直链霉菌。将烯酰吗啉分别与冷却至50 ℃的NA、高氏一号培养基混匀，配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μg/mL的含毒平板，以不含烯酰吗啉的平板为对照。每个培养皿加入100 μL适宜质量浓度的菌悬液进行涂布，每个质量浓度3个重复，28 ℃培养箱中分别培养1、4 d后，统计各个培养皿内的菌落个数，计算抑制率。

菌落抑制率=(对照菌落数-处理菌落数)/对照菌落数×100%。

2 结果与分析

2.1 烟草病原菌对烯酰吗啉的敏感性

2.1.1 烟草疫霉对烯酰吗啉的敏感性 采用菌丝生长速率法测定烟草疫霉对烯酰吗啉的敏感性,结果发现，烯酰吗啉对烟草疫霉菌丝生长具有很好的抑制作用，随着烯酰吗啉质量浓度的增加，烟草疫霉的菌落直径逐渐减小(图1)，当烯酰吗啉的质量浓度为1.0 μg/mL时，对烟草疫霉菌丝生长的抑制率达到86.76%(表1)。经DPS软件进行数据分析，烟草疫霉菌丝生长对烯酰吗啉敏感性的毒力回归方程为y=3.091 3x+6.020 4，EC50为0.467 6 μg/mL，相关系数r为0.994 8。

a.CK; b.0.2 μg/mL; c.0.4 μg/mL; d.0.6 μg/mL; e.0.8 μg/mL; f.1.0 μg/mL

项目Item烯酰吗啉质量浓度/(μg/mL)Concentration of dimethomorph00.20.40.60.81.0抑制率/%Inhibition rate014.4837.5860.7776.2086.76毒力回归方程Toxic regression equationy=3.091 3x+6.020 4EC50/(μg/mL)0.467 6相关系数Correlation coefficient0.994 8

通过孢子抑制法发现，烟草疫霉孢子囊的形成对烯酰吗啉敏感。随着烯酰吗啉质量浓度的增加，烟草疫霉孢子囊数目逐渐减少(图2)，当烯酰吗啉质量浓度为0.7 μg/mL时，对烟草疫霉孢子囊形成的抑制率为80.0%(表2)，表明烯酰吗啉可以有效抑制烟草疫霉孢子囊的形成。

2.1.2 瓜果腐霉、立枯丝核菌、茄病镰刀菌菌丝生长对烯酰吗啉的敏感性 用菌丝生长速率法测定瓜果腐霉、立枯丝核菌、茄病镰刀菌对烯酰吗啉的敏感性，结果发现，这3种土传病原真菌菌丝生长对烯酰吗啉不敏感。随着烯酰吗啉质量浓度的增加，瓜果腐霉、立枯丝核菌、茄病镰刀菌菌落直径没有明显变化(表3)。当烯酰吗啉质量浓度为0.5 μg/mL时，对瓜果腐霉、立枯丝核菌、茄病镰刀菌菌丝生长的抑制率分别为-2.00%、7.12%、0；烯酰吗啉质量浓度为8.0 μg/mL时，对其菌丝生长的抑制率分别为0、11.02%、4.78%。表明施用烯酰吗啉防治烟草疫霉时，对瓜果腐霉、立枯丝核菌、茄病镰刀菌菌丝生长无明显抑制作用。

a.CK; b.0.1 μg/mL; c.0.2 μg/mL; d.0.3 μg/mL; e.0.4 μg/mL; f.0.5 μg/mL; g.0.6 μg/mL; h.0.7 μg/mL

烯酰吗啉质量浓度/(μg/mL)Concentration of dimethomorph随机视野的孢子囊数/个Number of sporangia in random view抑制率/%Inhibition rate01000.19.673.30.26.3336.70.35.6743.30.44.3356.70.53.4465.60.62.4475.60.72.0080.0

表3 烯酰吗啉对瓜果腐霉、立枯丝核菌、茄病镰刀菌菌丝生长的抑制作用

2.2 生防菌株对烯酰吗啉的敏感性

2.2.1 哈茨木霉菌丝生长及分生孢子分化对烯酰吗啉的敏感性 通过菌丝生长速率法和孢子抑制法测定生防菌株哈茨木霉对烯酰吗啉的敏感性，结果发现，其菌丝生长及分生孢子分化对烯酰吗啉不敏感。当烯酰吗啉质量浓度为0.5 μg/mL时，对哈茨木霉菌丝生长及分生孢子分化的抑制率分别为-1.67%、-19.00%；烯酰吗啉质量浓度为4.0 μg/mL时，对其菌丝生长及分生孢子分化的抑制率分别为11.98%和28.94%(表4)。表明施用烯酰吗啉防治烟草疫霉时，可以与生防菌株哈茨木霉联合使用。

2.2.2 枯草芽孢杆菌与金黄垂直链霉菌对烯酰吗啉的敏感性 通过稀释涂布平板法测定发现，生防菌株枯草芽孢杆菌、金黄垂直链霉菌对烯酰吗啉不敏感。烯酰吗啉质量浓度为0.5 μg/mL时，对枯草芽孢杆菌、金黄垂直链霉菌无明显抑制作用；烯酰吗啉质量浓度为3.0 μg/mL时，对其抑制率为-10.37%、17.85%(表5)。表明施用烯酰吗啉防治烟草疫霉时，可以与生防菌株枯草芽孢杆菌或金黄垂直链霉菌联合应用。

表4 烯酰吗啉对哈茨木霉菌丝生长及分生孢子分化的抑制作用Tab.4 Inhibition of dimethomorph on mycelium growth and conidia differentiation of T.harzianum

表5 烯酰吗啉对枯草芽孢杆菌和金黄垂直链霉菌的抑制作用Tab.5 Inhibition of dimethomorph on B.subtilis and S.aureoverticillatus

3 结论与讨论

烯酰吗啉为吗啉类杀菌剂，可用于防治由鞭毛菌亚门卵菌纲真菌引起的蔬菜霜霉病、疫病等病害[13]，可以干扰病原菌细胞壁聚合体的组装，抑制菌丝生长，以及孢子囊、游动孢子、休眠孢子的萌发和游动孢子囊的形成[14]。本试验结果表明，烯酰吗啉显著抑制了烟草疫霉菌丝生长和孢子囊的产生，对菌丝生长的EC50为0.467 6 μg/mL，与战徊旭等[15]的研究结果一致。

单一使用烯酰吗啉防治烟草黑胫病，易导致烟草疫霉抗药性发生[16]。胡燕[17]测定了烯酰吗啉对烟草疫霉继代培养物的毒力，结果表明,烟草疫霉对烯酰吗啉存在较大的抗药性风险。牟文君等[18]通过烟草疫霉敏感菌株与抗性菌株纤维素合酶基因序列的比对，检测到纤维素合酶基因CesA3上存在V1109L突变和Q1077H突变，说明烟草疫霉同时存在2种突变位点。

生防菌不仅可以抑制病原菌的生长，而且有促进植物生长的作用[19]；但受环境条件、使用方法等的影响，防效不稳定[20]。为了解决生防制剂见效慢、防效不稳和化学杀菌剂存在的抗药性及农药残留等问题，可以将生防菌剂和化学杀菌剂混合使用，起到优势互补、降低农药使用量、增强防效和扩大病害防治范围的作用[21]。牟文君等[22]研究表明， 烯酰吗啉与氟吡菌胺、解淀粉芽孢杆菌混合使用防治烟草黑胫病，较单独使用生防菌剂和杀菌剂防效分别提高了22.93%、29.49%。本试验结果表明，烯酰吗啉对供试生防菌株哈茨木霉、枯草芽孢杆菌、金黄垂直链霉菌几乎没有抑制作用，但烯酰吗啉与供试生防菌联合后的田间防治效果需要进一步探究。

烯酰吗啉对烟草疫霉菌丝生长及孢子囊形成有显著抑制作用，对烟草疫霉菌丝生长的EC50为0.467 6 μg/mL；烯酰吗啉质量浓度为4.0 μg/mL时，对哈茨木霉菌丝生长及分生孢子分化的抑制率分别为11.98%和28.94%,对瓜果腐霉、立枯丝核菌、茄病镰刀菌的抑制率分别为-4.60%、3.90%、5.42%；烯酰吗啉质量浓度3.0 μg/mL时，对枯草芽孢杆菌、金黄垂直链霉菌的抑制率为-10.37%、17.85%。烯酰吗啉可以和供试生防菌株联合施用防治烟草黑胫病。