灰葡萄孢蛋白质毒素的致病性研究

孔 琼，袁盛勇，李 珣，薛春丽，李林倩，余朝阳，杨红玉

(1.红河学院 生命科学与技术学院，云南 蒙自 661100； 2.昆明学院，云南 昆明 650214)

灰葡萄孢(Botrytiscinerea)是一种常见的植物病原真菌，危害200多种植物，侵染植物的花、叶、茎秆等不同器官，造成腐烂和萎蔫[1]，主要通过杀死宿主细胞、分解宿主组织以及阻碍宿主防御反应等方式引起寄主植物发病[2]。大量文献研究表明，灰葡萄孢可通过产生细胞壁降解酶(纤维素酶、蛋白酶、内源多聚半乳糖醛酸酶)、激素(脱落酸)、毒素(倍半萜类毒素、草酸)[3-6]等侵染寄主植物，杀死细胞，从而使植物组织发生坏死。

病原真菌产生的毒素、激素和酶类往往是引发寄主植物生病的主要因子[7]。灰葡萄孢产生的毒素根据其分子质量不同分为大分子毒素和小分子毒素，其中有关有机类小分子毒素的研究报道较多。有机类小分子毒素主要有botrydial、dihydrobotrydial、2,3-dihydroxyprenylisoflavone、β-(1,3)(1,6)-D-glucan、botcinolide、7-O-menthylluteone等[8-10]，可引起细胞裂解，从而造成寄主植物枯黄。根据寄主范围不同可将真菌毒素分为寄主选择性毒素和非寄主选择性毒素。寄主选择性毒素对寄主植物具有特异生理活性和高度专化性作用位点，对寄主外的植物无致病性，如维多利亚长蠕孢(Helminthosporiumvictoriae)产生的HV毒素侵染燕麦引起疫病，作用于细胞膜；链格孢番茄致病型(Alternariaalternatetomato pathotype)产生的AAL脂类毒素能引起番茄发生茎枯病，作用于线粒体[11]。非寄主选择性毒素对寄主和非寄主植物都具有一定致毒活性和非特异性作用位点，在一定浓度下才能引起植物的敏感性反应，如黄曲霉(Aspergillusflavus)分泌的AFV毒素会引起玉米、花生叶片褪绿或种子腐烂；串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)、禾谷镰刀菌(F.gramnearum)和花腐镰刀菌(F.anthophilum)产生的串珠镰刀菌毒素(M-toxin)能引起小麦赤霉病、玉米穗腐病和马脑白质软化症等[12]。真菌毒素可通过破坏寄主植物叶片细胞膜、线粒体、叶绿体等结构，从而引起光合作用、核酸代谢和蛋白质合成等生理生化过程发生紊乱，最终导致植物表现出不同的发病症状[13]。鉴于此，分别测定灰葡萄孢蛋白质毒素对23种不同植物叶片的致病性和对7种植物种子的寄主专化性，为了解灰葡萄孢致病因子和病原真菌毒素的致病机制提供数据参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 灰葡萄孢蛋白质毒素的制备 灰葡萄孢菌种分离于番茄灰霉病株，保存于红河学院生命科学与技术学院实验室。将灰葡萄孢菌接种于PSA平板，25 ℃暗培养4 ～ 5 d。将菌丝块接种到PS液体培养基，于25 ℃、200 r/min振荡培养20 d，分别通过快速、中速和慢速抽滤，取出菌丝，将滤液于4 ℃、5 000 r/min 离心 20 min。取上清液装入截留分子质量为14 ku的透析袋内，于4 ℃条件下双蒸水透析5 d(每天换3 ～ 4次双蒸水)。用0.22 μm微孔膜过滤，冷冻干燥，使其呈粉末状，再配制成所需浓度备用。夏绍嫘[14]前期对该粉末成分进行了分离分析，发现蛋白质占75.8%，因此，将该大分子毒素命名为蛋白质毒素。灰葡萄孢蛋白质毒素(该蛋白质毒素能引起烟草悬浮细胞发生程序化死亡)的质量浓度为0.022 6 mg/mL。

1.1.2 供试植物选取 选取健康无病虫害的16科23种植物叶片作为灰葡萄孢蛋白质毒素致病性测定的试验材料。其中，BY-2烟草、桂花、美人蕉、枇杷、菊花、番茄、花叶鸭脚木、仙羽蔓绿绒、朱顶红、芒果、金叶女贞、三角梅、连翘、鸡蛋花等14种植物采自红河学院校园，叶用莴苣、葡萄、橘子、辣椒、栀子花、芦荟、蚕豆、豌豆、四季豆等9种植物购于市场。灰葡萄孢蛋白质毒素非寄主专化性测定所用大白菜、萝卜、辣椒、番茄、豌豆、蚕豆、四季豆等7种供试植物种子购于农资公司。

1.2 灰葡萄孢蛋白质毒素对不同植物致病性测定

采用针刺渗入法对23种植物叶片进行离体接种。接种前先将离体叶片用75%乙醇擦拭，再用无菌水清洗表面3次，用一次性注射器针头于供试植物叶片表面(避开叶脉)刺1个小孔，去掉针头，从小孔处渗入蛋白质毒素，每片10 μL，以无菌水为对照，5次重复。接种24 h遮光保湿培养后，于人工气候培养箱中进行光照与黑暗交替培养(L∶D=12 h∶12 h)，每天观察发病情况，7 d后统计叶片病斑面积大小。

1.3 灰葡萄孢蛋白质毒素对不同寄主的专化性测定

选取大白菜、萝卜、辣椒、番茄、豌豆、蚕豆、四季豆种值物大小和饱满程度相似的种子，经5%次氯酸钠溶液浸泡20 min后，用无菌水冲洗2～3次，再用灰葡萄孢蛋白质毒素浸种5 h，最后进行保湿培养(含有5 mL蛋白质毒素)，3 ～ 8 d观察结果。培养条件：温度为26 ℃、湿度为80%，暗培养。以无菌水处理作为对照，测定毒素对种子萌发及胚芽生长的影响(胚芽长度超过种子长轴长度1/2时计为萌发，从胚芽与种子的连接处到胚芽尖端的长度计为胚芽长度)。

萌发抑制率=(对照萌发率-处理萌发率)/对照萌发率×100%；

生长抑制率=(对照胚芽长度-处理胚芽长度)/对照胚芽长度×100%。

1.4 数据处理

数据经Excel 2013整理后，采用SPSS 18.0软件进行分析，用单因素新复极差法进行显著性区分(P<0.05)，数据结果采用平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 灰葡萄孢蛋白质毒素致病性分析

2.1.1 植物发病表型观察 通过渗透离体接种试验，发现被灰葡萄孢蛋白质毒素侵染的植物叶片可出现斑点、黄化、萎蔫和腐烂等病状。其中，蚕豆、豌豆、四季豆(豆科)，番茄、辣椒、烟草(茄科)，菊花、叶用莴苣(菊科)，连翘、桂花(木犀科)，葡萄(葡萄科)，鸡蛋花(夹竹桃科)，仙羽蔓绿绒(天南星科)，枇杷(蔷薇科)，朱顶红(石蒜科)，芒果(漆树科)和花叶鸭脚木(五加科)这17种供试植物叶片均在接种部位出现软化、变褐、变黄甚至腐烂的现象。渗入无菌水的叶片培养7 d后无任何症状出现(图1B、1D)，叶片颜色正常；而渗入灰葡萄孢蛋白质毒素后的朱顶红叶片于第3天开始发病，起初为水渍状和淡黄色斑块，面积较小，随后病斑扩大，第7天时叶片表现为褪绿、变褐、变黄，接种处边缘有明显的水渍状且病斑易腐烂(图1A)。相似的现象也出现于番茄叶片上(图1C)。

而芦荟(百合科)、三角梅(紫茉莉科)、金叶女贞(木犀科)、橘子(芸香科)、栀子花(茜草科)和美人蕉(美人蕉科)6种供试植物叶片渗入灰葡萄孢蛋白质毒素7 d后，植物叶片无任何病状(图1E、1G)，与无菌水处理无差异(图1F、1H)。

A.渗入灰葡萄孢蛋白质毒素的朱顶红叶片；B.渗入无菌水的朱顶红叶片；C.渗入灰葡萄孢蛋白质毒素的番茄叶片； D.渗入无菌水的番茄叶片；E.渗入灰葡萄孢蛋白质毒素的栀子花叶片；F.渗入无菌水的栀子花叶片；G.渗入灰葡萄孢蛋白质毒素的三角梅叶片；H.渗入无菌水的三角梅叶片

2.1.2 灰葡萄孢蛋白质毒素致病性测定 从表1可看出，在供试的23种植物中，灰葡萄孢蛋白质毒素能引起17种植物叶片发病，且出现症状，占全部供试植物的73.91%。其中，石蒜科的朱顶红叶片发病较严重，其病斑面积最大，为(2.18±0.44)cm2，显著高于其他处理；其次为茄科的辣椒和五加科的花叶鸭脚木2种植物，病斑面积分别为(0.81±0.33)cm2、(0.80±0.13)cm2，但二者差异不显著。之后，分别是菊科的菊花和莴苣、茄科的番茄和烟草、豆科的蚕豆和豌豆。木犀科的连翘和四季桂、天南星科的仙羽蔓绿绒、漆树科的芒果发病最轻，病斑较小。综上，灰葡萄孢蛋白质毒素对石蒜科、茄科、五加科、菊科和豆科植物叶片的致病性较强，而对百合科的芦荟、紫茉莉科的三角梅、木犀科的金叶女贞、芸香科的橘子、茜草科的栀子花、美人蕉科的美人蕉无致病性。

表1 灰葡萄孢蛋白质毒素对不同植物的致病情况Tab.1 Pathogenicity of protein toxin secreted from Botrytics cinerea on different plants

注：“+”表示发病，“-”表示不发病。同列数据后不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

Note: “+” means pathogenic; “-” means non-pathogenic.Data with different letters in the same column mean significantly different(P<0.05),the same below.

2.2 灰葡萄孢蛋白质毒素寄主专化性分析

通过种子萌发试验，发现灰葡萄孢蛋白质毒素对7种非寄主植物种子萌发具有抑制作用。用灰葡萄孢蛋白质毒素处理的豌豆种子于处理后第6天才开始萌发，而空白对照则第3天就开始萌发，其萌发率明显低于空白对照；相似的结果也表现于大白菜种子萌发试验中。在处理的7种供试植物种子中，灰葡萄孢蛋白质毒素对十字花科大白菜种子抑制影响尤为明显，萌发抑制率最高，达84.21%，其次分别是蚕豆(79.61%)、豌豆(79.44%)、四季豆(68.09%)、番茄(64.83%)、萝卜(58.92%)，对辣椒的抑制作用最小，萌发抑制率仅为41.08%(表2)。经灰葡萄孢蛋白质毒素处理后，7种植物种子的胚芽生长也受到抑制。其中，对大白菜胚芽生长抑制作用最明显，生长抑制率达到86.55%，其次是四季豆，生长抑制率为 80.03%，对番茄胚芽生长的抑制作用最小，生长抑制率为58.36%。

表2 灰葡萄孢蛋白质毒素对7种植物种子萌发和胚芽生长的影响

3 结论与讨论

植物病原真菌在引起寄主发生病害过程中，往往通过代谢产生的毒素破坏寄主细胞壁、细胞膜、线粒体和叶绿体等器官，从而导致寄主植物生理生化失调，影响寄主植物水分、蛋白质、核酸、酶类和酚类代谢紊乱，最终致使寄主植物死亡[11]。毒素的化学组分较复杂，主要有多糖及糖苷类化合物[棉花黄萎病菌(Verticilliumdahliae)分泌的糖类毒素][15]、肽和蛋白质类化合物[大麦条纹病菌(Pyrenophoragraminea)分泌的糖肽类毒素、烟草黑胫病菌(Pytophthoranicotianae)分泌的糖蛋白质类毒素][16-17]、酯类化合物[甜菜尾孢菌(Cercosporabeticola)产生的甘油三酯毒素][18]、芳环和杂环类化合物[大蒜白斑病菌茄匍柄霉(Stemphyliumsolani)分泌的酚类毒素、百日草链格孢菌(Alternariazinniae)产生的酚类毒素][18-19]、萜和甾类[尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和串珠镰刀菌(F.moniliforme)分泌的菲醌甾类毒素和单端孢霉烯、类胡萝卜素萜类毒素][20]、氨基酸衍生物类化合物[细极链格孢菌(Alternariatenuissima)分泌的细链格孢酮酸毒素][21]等，这些化合物对寄主植物都有一定的毒性，只是强弱程度不同。本研究从灰葡萄孢培养滤液中所提取的毒素是胞外大分子物质，为蛋白质。

前人研究发现，灰葡萄孢分泌产生的大分子毒素能引起拟南芥(十字花科)、番茄和辣椒(茄科)、朱顶红(石蒜科)等17种植物发生病害，但不能危害百合科的百合、冬青科的伞花冬青和紫茉莉科的三角梅[22]。本研究中，灰葡萄孢蛋白质毒素能引起供试植物叶片褪绿、变黄、变褐、逐渐腐烂的现象；同时通过毒素渗入接种试验发现，该毒素能引起供试的17种植物发生症状，占供试植物的73.91%，而对百合科的芦荟、紫茉莉科的三角梅和木犀科的金叶女贞等6种植物无致病性；对供试7种农作物种子萌发和胚芽生长均有一定的抑制作用。研究结果进一步证实了灰葡萄孢蛋白质毒素具有致病性且寄主范围广，是一种非寄主专化性毒素，但其理化性质、作用位点及毒素钝化剂的研发还有待进一步研究，以期为灰葡萄孢致病机制和由其引起的病害防治提供新的策略。