三种李果皮蜡质的结构与成分比较

黄世安 林 欣 张 琴 陈 红 朱守亮 马玉华 董晓庆

(1贵州大学农学院，贵州 贵阳 550025； 2贵州省果树工程技术研究中心， 贵州 贵阳 550025；3贵州省果树蔬菜工作站，贵州 贵阳 550025; 4贵州省农业科学院果树科学研究所，贵州 贵阳 550025)

果皮蜡质是覆盖在果实最外层的一类有机混合物的总称，是果实最直接的保护层。作为保护果实的第一道屏障，果皮蜡质能够抵御各种生物和非生物胁迫[1]，在果实发育和贮藏期间发挥重要保护作用[2-3]。此外，一些果实在发育过程中会因为蜡质的存在而形成白色蜡霜[4]。果皮蜡质由蜡质晶体构成的外蜡和镶嵌在外部角质层的无定形内蜡组成，主要含有脂肪酸、烷烃、醇类、醛类、酮类、酯类以及三萜类化合物等[5]，蜡质晶体主要有片状、管状、丝状、杆状、颗粒状和平板状结构[6]。

在苹果、柑橘、梨等果实生产中常常通过机械打蜡，起到类似于自发气调贮藏的方式来提高果实耐贮性[7-9]，但人工果蜡使用不当会堵塞果实皮孔，阻碍气体交换，导致果实在贮藏过程中产生异味，降低其品质[10]。而天然果皮蜡质不会造成这种情况，因此对于天然果皮蜡质的研究显得尤为必要。在以往的研究中，三萜类化合物和β-二酮是蓝莓蜡质中含量最高的成分，其中烷烃、伯醇和脂肪酸含量起到决定蓝莓果实失重的作用[4]。苹果蜡质中的烷烃成分可保持果实水分、减缓果实软化[11-12]；烷烃和醛是生成柑橘板状蜡质的必需物质，并且烷烃和三萜能控制果实角质层水渗透[13-14]；梨果皮蜡质中，二十九烷和十八碳醛可保持果实品质，其中烯烃和脂肪酸含量与果实硬度显著负相关[15]。

李果实是贵州省重点支持发展的果品之一，李产业成为全省决战脱贫攻坚、决胜小康的主力军。李果实采后品质降低、耐贮性下降，影响果实长期贮藏[16]。虽然给李果实打蜡能提供一种新的贮藏保鲜措施，但是对李天然果蜡的特性研究鲜有报道。本研究选择具有代表性的3种李，分析不同品种间果皮表面结构、蜡质含量和蜡质成分差异，旨在为进一步开展贮藏时期李果皮蜡质结构和成分变化研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

选择形状大小、可溶性固形物含量(total soluable solid, TSS)和硬度一致，无损伤的空心李、蜂糖李和脆红李果实为研究对象。其中，空心李(TSS：8.7～10.6%，硬度：5.5～7.0 kg·cm-2)采摘自贵州省沿河土家族自治县，蜂糖李(TSS：13.3～15.5%，硬度：10.2～11.7 kg·cm-2)采摘自贵州省六马县，脆红李(TSS：9.4～10.1%，硬度：9.8～12.0 kg·cm-2)采摘自贵州省农业科学院果树科学研究所百宜基地。配戴聚氯乙烯手套人工采摘，采摘时轻拿轻放，尽量减少对李蜡霜的损伤。采摘后将果实放于塑料篮子(540 mm× 360 mm×310 mm)，4 h內运送到实验室进行处理，果实采摘后预冷一夜。

双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺[bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide, BSTFA]+ 1%三甲基氯硅烷(trimethylchlorsosilane, TMCS)硅烷化试剂、正构烷烃混标(均为色谱纯)，购于上海安谱实验科技股份有限公司；戊二醛50%、甲醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、叔丁醇、氯仿(均为分析纯)，购于成都金山化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

E-1010离子溅射仪、S3400N型扫描电子显微镜，日本日立公司；7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪、色谱柱DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，美国安捷伦公司；MD200-2干式氮吹仪，上海沪析实业有限公司；RE-5200A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；SB-5200DT超声波清洗机，宁波新芝生物科技有限公司；LNG-T98冷冻浓缩离心干燥器，太仓市华美生化仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 果皮蜡质结构观测 3个品种各选择3个果实，每个果子在赤道处(果脐正对处，两侧面)3个点取样，观察果皮蜡质结构。取3 mm×3 mm×2 mm的果皮，加入100 μL 2.5%戊二醛固定果皮切片，固定12 h后将果皮切片加入1 mL pH值7.0的2.0%磷酸盐缓冲液中浸泡3 min，用梯度叔丁醇(50%、70%、90%)分别脱水后，再用100%叔丁醇脱水2次，每次10 min，脱水后真空干燥[17]。待离心管内的冰晶挥发干后取出粘台，经E-1010离子溅射仪喷金，在S3400N型扫描电子显微镜上观察蜡质结构。

1.3.2 果皮蜡质提取 蜡质提取：取3个500 mL烧杯，分别倒入300 mL三氯甲烷/甲醇(V/V∶4/1)，使用自制铁丝夹夹住1个果实依次在3个烧杯中提取。期间不断用自制铁丝夹夹住果实在溶液中搅动，此过程不可破坏果皮，在通风橱内完成。每个品种3次重复，每个重复5个果实。

提取条件：将烧杯置于40℃的超声波清洗器中提取30 s。

浓缩转移：果皮蜡质提取后，将5个果实3个烧杯中的蜡质提取液转移到圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上进行蜡质提取液的浓缩，完成蜡质浓缩后，倒入20 mL三氯甲烷/甲醇至圆底烧瓶中，摇匀并置于超声波清洗器震荡，充分溶解瓶壁蜡质[2]。将浓缩液转移至40 mL棕色玻璃螺口瓶中，在氮气下吹干至恒定质量(30 min内蜡质变化不超过10 mg)，并称取提取物质量。

蜡质含量测定：使用电子游标卡尺测量提取蜡质后的李果实横径(d1)、纵径(d2)、高(h)，根据式(1)计算单个果实表面积(S)；再用差量法求得提取物质量，根据式(2)计算果皮提取物含量(μg·cm-2)。

(1)

(2)

1.3.3 果皮蜡质成分测定 取出吹干的蜡质样本加入10 mL氯仿复溶，涡旋30 s，超声10 min后取5 mL提取液，氮吹仪吹干后加入200 μL的BSTFA(含1%TMCS)衍生化试剂，在70℃烘箱内反应1 h，室温静置30 min。再加入1 mL氯仿复溶，涡旋2 min，超声10 min，静置10 min后室温离心10 min(12 000 r·min-1， 25℃)，取300 μL上清液过0.22 μm有机相滤膜，转移至带衬管的玻璃瓶中，进行气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry, CC-MS)代谢组学分析。使用20 μg·mL-1浓度的正构烷烃混标(C7-C40)，转移至带衬管的玻璃瓶中。

色谱条件：DB-5MS毛细管柱，载气为高纯氦气(He，纯度>99.999%)，流速1.0 mL·min-1，进样口温度260℃；升温程序：初温80℃保持2 min，再以 15℃·min-1升至260℃，保持10 min，最后以5℃·min-1升至315℃，保持10 min。质谱条件：电子轰击离子源，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，电子能量70 eV。扫描方式为全扫描模式(SCAN)，质量扫描范围：m/z 50～500。

1.4 数据分析

使用独立数据采集方法获取片段离子，经Analysis Base File Converter软件转换为abf格式，之后导入MS-DIAL软件进行预处理，导出原始数据矩阵，采用NIST数据库进行物质定性分析，对所有峰面积根据筛选后RSD(ALL)<0.3的内标进行分段归一化处理确定其相对含量。人工筛选出具体的蜡质组分后采用Excel 2016办公软件对数据进行整理与分析，用OriginPro 2021作图。利用DPS软件中的Duncan’s新复极差法中5%显著差异进行多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 3种李果皮表面结构

注：1，2：空心李果皮蜡质结构；3：空心李果皮皮孔；4，5：蜂糖李果皮蜡质结构；6：蜂糖李果皮皮孔；7，8：脆红李果皮蜡质结构；9：脆红李果皮皮孔；SE为放大倍数。Note: 1, 2: Peel surface structure of Kongxin plum. 3: Lenticel of Kongxin plum fruit. 4, 5: Peel surface structure of Fengtang plum fruit. 6: Lenticel of Fengtang plum. 7, 8: Peel surface structure of Cuihong plum fruit. 9: Lenticel of Cuihong plum fruit. SE is the magnification.图1 3种李果皮照片和果皮表面结构扫描电镜图Fig.1 Photographs of fruit and scanning electron microscope of peel surface structure in three varieties plum

如图1所示，3种李果皮上均覆盖有白霜状蜡质，空心李、蜂糖李和脆红李果皮表面的蜡质覆盖面积分别为70%～90%、50%～70%和20%～40%。观察果皮蜡质扫描电镜图，空心李果皮有大量堆叠的片状蜡质，也有杆状蜡质结构，在杆状的节点上会聚集絮状或颗粒状结构。蜂糖李果皮上明显分布着颗粒状蜡质晶体，含有大量大小不一、不规则小圆片状蜡质晶体以及少部分杆状蜡质。脆红李果皮既有呈不规则小圆片状蜡质晶体，也有大量堆叠的杆状蜡质结构形成的网络。在300倍的扫描电镜下，空心李和脆红李的皮孔为圆形，大小在20～40 μm之间，皮孔周围覆盖嚼烂状蜡质，部分皮孔上覆盖有蜡质。在200倍的扫描电镜下，蜂糖李皮孔为椭圆形，大小在300～600 μm之间，皮孔较空心李和脆红李大，且两侧副卫细胞有角质加厚。

2.2 3种李果皮提取物含量差异

如图2所示，3个品种李中空心李果皮蜡质含量最高，为3 439.83 μg·cm-2；其次是蜂糖李，为2 012.69 μg·cm-2；脆红李最低，为895.22 μg·cm-2，3种李之间蜡质含量存在显著差异(P<0.05)。

注：不同字母表示不同品种蜡质含量在0.05水平上有显著差异。Note: Different letters indicate that wax content of different varieties of plum has significant difference at 0.05 level.图2 3种李果皮蜡质含量Fig.2 Content in peel wax of three varieties plum

2.3 3种李果皮蜡质成分

2.3.1 3种李果皮蜡质组分差异 GC-MS分析结果表明，李果皮的三氯甲烷/甲醇(V/V∶4/1)提取物中共分析出87种蜡质成分，3种李果皮蜡质成分基本一致，主要包括脂肪酸、烷烃、醇类、醛类、酯类、酮类、三萜类化合物等，但不同成分含量比例不同。对3种李果皮蜡质组成进行主成分分析，如图3-A所示。在主成分分析的评分图中，第1和第2主成分的特征值分别为3.66和2.38，贡献率分别为52.25%和34.04%，累积贡献率为86.29%。脆红李在第1主成分上得分最高，蜂糖李在第1主成分上得分最低；空心李在第2主成分上得分最高，与蜂糖李和脆红李相比在第2主成分上差别较大。3种李果皮蜡质组分和相对含量差别较大，组分区分明显。3种李中，蜂糖李中脂肪酸含量相对较高，脆红李中酮类含量相对较高。

由图3-B可知，3种李蜡质组分含量最高的是醇类，占蜡质总量比例分别为60.08%、65.38%和50.38%。其次是烷烃，在空心李、蜂糖李和脆红李中分别占19.08%、23.23%和19.60%。空心李和脆红李果皮蜡质中三萜类化合物含量高于蜂糖李，分别占14.40%和18.73%。3个品种中脂肪酸含量以蜂糖李最高，占5.85%，脆红李次之，空心李最低。脆红李和空心李中酯类含量高于蜂糖李，分别占4.67%和2.57%。醛类含量相差不大，脆红李中含量最高，占2.97%。李表皮蜡质代谢物中酮类含量极低，占蜡质总量少于1%。空心李果皮蜡质中各组分所占比例从高到低依次为醇类>烷烃>三萜类化合物>酯类>脂肪酸>醛类>酮类。蜂糖李果皮蜡质中各组分所占比例从高到低依次为醇类>烷烃>脂肪酸>酯类>醛类>三萜类化合物>酮类。脆红李果皮蜡质中各组分所占比例从高到低依次为醇类>烷烃>三萜类化合物>酯类>醛类>脂肪酸>酮类。

图3 3种李果皮蜡质组分主成分分析(A)和百分比(B)Fig.3 The principal component analysis (A) and percentage (B) of peel wax compositions of three varieties plum

2.3.2 3种李果皮蜡质成分及含量显著性 由表1知，使用平均保留时间确定代谢物名称，分析出87种蜡质成分，包含20种醇类、12种烷烃、23种脂肪酸、15种酯类、6种醛类、8种酮类以及3种三萜类化合物。3种李果皮中分析出的16种醇类、6种烷烃、19种脂肪酸、12种酯类、5种醛类、6种酮类以及3种三萜类化合物的含量存在显著差异(P<0.05)。

表1 3种李果皮蜡质成分和含量显著性Table 1 Significance of peel wax compositions and content of three varieties plum

表1(续)

表1(续)

图4 3种李果皮蜡质组分聚类热图分析Fig.4 Clustering heatmap analysis in peel wax compositions of three varieties plum

2.3.3 3种李果皮表皮蜡质的组成 如图4所示，对3个品种中的87种蜡质成分以及醇类、伯醇、仲醇、不饱和醇、二元醇、烷烃、直链烷烃、支链烷烃、脂肪酸、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、酯类、酮类、醛类、饱和醛、不饱和醛和三萜类化合物含量进行热图结合层次聚类分析。结果显示3种李蜡质成分区分明显，与主成分分析结果一致。空心李与脆红李的成分聚类在一起，但空心李距离蜂糖李较远，说明空心李与脆红李的蜡质成分相近，与蜂糖李差异性较大。3种李中空心李的醇类含量最高，尤其是伯醇中十八醇、二十六醇与二元醇的1,11-十一烷二醇、1,30-三十烷二醇；仲醇在李果皮蜡质中含量极低，但在蜂糖李中含量高于脆红李以及空心李。直链烷烃与支链烷烃在脆红李中含量最低，支链烷烃在空心李中含量最高。李蜡质中，二十九烷是含量最高的烷烃成分，在蜂糖李中含量最高。饱和脂肪酸与饱和醛在蜂糖李中含量最高，不饱和脂肪酸与不饱和醛在脆红李中含量最高。酮类在脆红李中含量最高，酯类在蜂糖李中含量最低。蜡质中三萜类物质，尤其是熊果醛、熊果酸在蜂糖李中的含量最低，在空心李中的含量最高。

如图5所示，对3种李果皮蜡质的二无醇和三萜类含量进行分析。其中二元醇包含1,11-十一烷二醇、1,12-十二烷二醇、1,30-三十烷二醇3种。3种李中，二元醇在空心李中含量最高，脆红李中最低。1,30-三十烷二醇是3种李中含量最高的二元醇，在空心李中含量最高，且显著高于其他2种李(P<0.05)。3种李中，空心李的三萜类含量最高，脆红李次之，蜂糖李最低。空心李中含量最高的三萜类是熊果醛，而且空心李的熊果醛和熊果酸含量显著高于其他2种李(P<0.05)。蜂糖李的熊去氧胆酸含量显著高于空心李(P<0.05)，而熊果醛、熊果酸含量极低。脆红李中含量最高的成分也是熊果醛，且含有较多的熊果酸，但几乎不含熊去氧胆酸。

注：不同字母表示同一成分不同品种间含量在0.05水平上有显著差异。Note: Different letters indicate that there are significant differences in the content of the same composition among different varieties at 0.05 level.图5 3种李果皮蜡质二元醇与三萜类的分布以及含量Fig.5 Distribution and content of glycols and triterpenes in fruits of three varieties of plum

3 讨论

不同物种以及同一物种的不同品种间蜡质含量也不同[2,12,14]。徐呈祥等[14]研究表明，采用三氯甲烷/甲醇(V/V∶3/1) 溶液提取砂糖橘与贡柑果皮蜡质，贡柑果皮蜡质含量高于砂糖橘。本试验用三氯甲烷/甲醇(V/V∶4/1)溶液提取3种李果皮蜡质，结果显示，蜡质含量存在显著差异(P<0.05)，其中空心李蜡质含量最高，蜂糖李次之，脆红李最低。不同方法提取果皮蜡质，蜡质含量也不相同。酶解法提取柑橘果皮蜡质的含量低于三氯甲烷/甲醇(V/V∶ 3/1)溶液提取法1～2个数量级[18]，使用火棉胶提取番茄果皮蜡质，其含量比三氯甲烷溶液提取的含量低[19]。使用不同有机溶剂提取果皮蜡质会影响蜡质含量与成分，一般使用正己烷提取非极性馏分，二氯甲烷提取弱极性馏分，甲醇提取极性馏分[20]。对于不同有机溶剂对李果皮蜡质的影响，贵州省果树工程技术研究中心董晓庆团队也对正己烷、三氯甲烷、三氯甲烷/甲醇(V/V∶ 4/1)三种提取剂进行了比较，结果显示三氯甲烷/甲醇(V/V∶ 4/1)蜡质含量最高(数据未发表)。

果皮中常见的蜡质结构有片状、管状、杆状、针状、颗粒状等类型，蜡质中主要包含脂肪族化合物、环状化合物以及甾醇类化合物等[21]。对大量植物表皮蜡质结构和成分的研究发现，蜡质结构和成分显著相关。表皮蜡质呈现的蜡质结构与蜡质成分含量相关，片状结构的蜡质含有大量醇和三萜类化合物；柱、管状结构的蜡质含有大量的酮和次级醇；杆、棒状结构的蜡质含有大量二酮，且含二酮的植物表皮会产生白霜状蜡质[22]；波浪状结构的蜡质含有大量烷烃[23]。

本研究中李果皮片状蜡质结构分布密度与李果皮蜡质中醇和烷烃含量密切相关。3种李果皮蜡质呈现不同的蜡质结构，与蜡质成分含量相关，此外，成分含量的差异可能会使不同的蜡质结构组合在一起。空心李和脆红李蜡质结构相似，即有大量堆叠的杆状蜡质结构，且在杆状的节点上会聚集絮状或者颗粒状晶体。3种李果皮上附着一层白霜状蜡质，空心李白霜状蜡质覆盖面积高于蜂糖李和脆红李，且空心李果皮蜡质呈现较多的杆状结构。对禾本科植物蜡质的研究发现禾本科表皮结构存在杆状结构，并在蜡质中检测出二酮物质[22,24]，但在本研究中虽有大量的杆状结构，并未检测出二酮物质。蜡质合成途径中仲醇是酮的前体，仲醇含量会影响酮与二酮的含量，3种李果皮蜡质中仲醇含量极低，极低的仲醇含量导致李果皮蜡质中酮及二酮的含量极低，与Priyanka等[25]研究蓝莓果皮蜡质的结果一致。此外，郝浩浩[26]在研究成熟柑橘果皮蜡质中同样没有检测出二酮物质，脐橙和椪柑果皮蜡质呈现不同形态的杆状结构，蜡质中含量最高的成分是醛类。

在一些研究中醇类也能形成杆状结构，并存在两种组分，一种组分是仲醇、10-二十九烷及其同系物和少量不对称二元醇[27]；另有一种组分是14,16-三十一烷二醇的对称二元醇[28]。空心李和蜂糖李含有较高的二元醇，尤其是空心李中的1,30-三十烷二醇的含量显著高于蜂糖李和脆红李。研究表明，呈杆状结构的蜡质组分中大多含有三萜类化合物[29]。本研究中空心李的杆状晶体结构比蜂糖李和脆红李密集，而且空心李蜡质中三萜类含量显著高于蜂糖李和脆红李，这可能是空心李果皮表皮白霜状蜡质极为丰富的原因。因此李果皮蜡质中对称二元醇和三萜类化合物对杆状蜡质结构以及白霜状蜡质的形成起重要作用。

Oliveira等[30]研究发现干旱的旱地林地区植被蜡质中主要含有极性低的物质，而湿润的热带草原地区主要含有极性高的物质，低极性物质能更有效的防止水分散失。Chai等[12]在研究10种苹果果皮蜡质发现，烷烃的相对含量与李果实贮藏性有直接关系。本研究中蜂糖李果皮蜡质中低极性物质烷烃含量比例高于空心李和脆红李，推测蜂糖李果实在生产中更耐贮藏。3种李果皮蜡质中饱和脂肪酸和饱和脂肪醛含量最高的是蜂糖李，最低的是脆红李；不饱和脂肪酸和不饱和脂肪醛含量最高的是脆红李，最低的是蜂糖李。对3种李蜡质成分与硬度和TSS的相关性分析中，醇类、烷烃以及三萜类与硬度呈负相关(R2分别为-0.841、-0.757和-0.634)，三萜类与TSS呈极显著负相关(R2=-0.991，P<0.01)，进一步说明三萜类与李果实品质有重要关系，但果皮蜡质中具体成分和李果实贮藏之间的关系还需进一步深入研究。

此外，3种李果皮蜡质中还存在黄酮类和蒽醌类，任玉琴等[31]研究发现李果实中黄酮类物质具有重要的抗氧化作用，Rajan等[32]研究发现蒽醌类物质具有抗炎杀菌的作用，但目前还未有研究报道这些物质对蜡质结构的形成是否起到作用以及如何作用，因此需要进一步深入研究和探讨。

4 结论

本研究通过分析3种李果皮结构以及果皮蜡质成分，发现蜡质成分及其含量的差异会使李果皮蜡质结构存在不同类型的组合。3种李中分析出7类87种蜡质成分，主成分分析结果显示3种李蜡质组分区别明显，聚类热图显示空心李与脆红李的蜡质成分相近，与蜂糖李差异较大。本研究发现蜡质中对称二元醇和三萜类化合物对李果皮蜡质杆状结构以及白霜状蜡质的形成起重要作用，并且三萜类化合物与李果实品质存在重要关系。