高迁移率族蛋白B1翻译后修饰与疾病①

刘蔚婷 石咏军 曹师荣

(惠州市中心人民医院,惠州 516001)

高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)是细胞核内一种含量丰富的DNA结合非组蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳时的快速迁移而得名。生理状态下，HMGB1在细胞核内参与DNA复制、转录、翻译，在细胞应激过程中，它经翻译后修饰(post-translational modifications，PTMs)，在细胞质中及细胞外以一种“晚期炎症介质”和“损伤相关模式分子”的新角色与不同受体结合，从而介导疾病的炎症发展及免疫应答。HMGB1不同亚型也在肿瘤的发生、浸润和转移的生物学行为中发挥不同作用。本文就HMGB1的PTMs在一些炎症、免疫及肿瘤疾病中的研究进展进行综述。

1 HMGB1及其翻译后修饰

1.1HMGB1的结构及功能 HMGB1是哺乳动物中表达最丰富和分布最普遍的核蛋白，其氨基酸序列同源性>98.5%[1]。人类HMGB1含有215个氨基酸残基，主要由A-box、B-box和C-tail 3个结构域组成。A-box和B-box为DNA结合域，而C-tail可增加A-box和B-box与DNA的亲和力。此外，HMGB1含有核定位序列(nuclear localization sequences，NLSs)和核输出序列(nuclear export sequences，NESs)，它们分别为核输入蛋白复合物和核输出蛋白复合物所识别。这些均是HMGB1能在细胞核和细胞质不断穿梭和发挥不同生物学作用的结构基础。生理状态下，细胞核内HMGB1的A、B-box通过结合和弯曲DNA结构共同参与DNA复制和稳定染色质结构，从而调节基因转录、重组以及促进DNA损伤修复等。在感染、细胞应激、免疫反应等情况下，HMGB1发生翻译后修饰，主要发生在A-box(含NLS1序列)和NLS2等结构上(图1)[2]，随后HMGB1呈现出核转运，并主动释放到细胞外，参与炎症的发生或反馈性调节程序性细胞死亡。

图1 HMGB1的结构及其翻译后修饰Fig.1 Structure of HMGB1 and its post-translatio-nal modifications

1.2HMGB1翻译后修饰的形式和功能 HMGB1有数种PTM形式，包括乙酰化、ADP-核糖基化、甲基化、磷酸化、糖基化和氧化(完全还原化、部分氧化、完全氧化)等。PTMs对HMGB1的亚细胞定位和生物学功能至关重要。不同的HMGB1亚型发挥不同的生物学活性。生理状态下，NLSs位点完全还原化使HMGB1主要定位在细胞核，使其参与染色质稳定以及DNA复制等基本生命活动过程。而HMGB1在NLSs位点上的乙酰化、甲基化和磷酸化均能促进其从胞核到胞质的易位并影响其生物学功能。在程序性细胞死亡(包括焦亡、坏死、凋亡、中性粒细胞胞外诱捕网等)或分泌溶酶体的介导下，细胞质中的HMGB1释放或分泌到细胞外。而HMGB1的氧化修饰决定了它在细胞外调节炎症和细胞死亡方式的能力，对激活炎症小体和细胞焦亡、促进自噬、对抗细胞凋亡等活动有着重要影响[2-6]。本文重点叙述HMGB1的乙酰化、甲基化、磷酸化和氧化修饰。

乙酰化：HMGB1乙酰化可发生在NLS的赖氨酸位点2(lysine，Lys2)和Lys11上。HMGB1的NLSs位点乙酰化是目前研究最多的调控HMGB1从胞核转向胞质的PTM[3]。脂多糖或干扰素等刺激因子通过JAK/STAT1信号通路诱导HMGB1的NLSs位点乙酰化，从而促进核HMGB1向细胞质易位[3]。乙酰化HMGB1可能通过与NLRP3受体结合，活化IL-1β和IL-18 等炎症因子，参与触发细胞焦亡，促进炎症发生[4,5]。

甲基化：髓细胞终末分化的过程中,中性粒细胞中的HMGB1在Lys42上发生单甲基化[7]。甲基化修饰通过改变A-box的构象，显著降低HMGB1的DNA结合活性,使HMGB1从中性粒细胞核转移到细胞质并成为抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)的新抗原[7]。

磷酸化：在脊椎动物中，HMGB1磷酸化由PKC、酪蛋白激酶Ⅰ等介导[8]。磷酸化对HMGB1结合和弯曲DNA的亲和力、核质分布和释放均有影响[8-10]。TNF-α通过依赖钙调蛋白依赖激酶IV的钙信号通路可使巨噬细胞中HMGB1的NLSs上多个丝氨酸残基(35、39、42、46、53和181)发生磷酸化，这降低了HMGB1与核输入蛋白复合物的结合力，从而促进其向细胞质转移及其最终的释放[10-12]。磷酸化HMGB1作为致炎因子参与一些炎症和免疫疾病过程，如缺血再灌注损伤[13]。

氧化：细胞外HMGB1的氧化修饰发生在它的三个关键半胱氨酸残基(cysteine，Cys)上，即Cys23、Cys45和Cys106位点。Cys23、Cys45和Cys106位点的氧化还原程度影响了HMGB1在细胞外调节炎症的能力：完全还原化HMGB1(SH-SH-SH)在Cys23、Cys45、Cys106 位点均连接硫醇侧链，它与趋化因子CXCL12形成复合物，通过趋化因子受体4(C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4)通路发挥趋化作用[14]。部分氧化HMGB1在Cys23和Cys45之间形成二硫桥，因此又称二硫化HMGB1(S-S-SH)，作为一个强力促炎因子通过Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)通路引发炎症反应[15-17]。完全氧化HMGB1的Cys23、Cys45、Cys106位点全被氧化，又称磺化HMGB1(R-SO3H)，它处于一种免疫惰性状态，不与CXCR4或TLR4结合，既无趋化活性也无促炎活性。由此可见，完全还原化和二硫化HMGB1有促进炎症发生的功能，而磺化HMGB1则可能起着抑制炎症发生的作用。

HMGB1的各种翻译后修饰既可独自发挥作用又有相互联系。如乙酰化、甲基化、磷酸化等修饰通过不同的信号通路各自促进HMGB1从细胞核转移到细胞外。氧化修饰中，具有趋化活性的完全还原化HMGB1和具有促炎活性的二硫化HMGB1相互协同促进炎症的发生发展，而不具免疫活性的磺化HMGB1则对完全还原化、二硫化HMGB1起拮抗作用[18]。

2 HMGB1翻译后修饰与疾病的关系

2.1HMGB1翻译后修饰与炎症

2.1.1脓毒症 脓毒症发生时,巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞中HMGB1的NLSs位点广泛乙酰化，使得HMGB1向细胞质移动并进一步被特异性分泌溶酶体包裹，随后乙酰化HMGB1即以胞吐的方式主动释放到胞外[19]。细胞外乙酰化HMGB1反过来刺激巨噬细胞、中性粒细胞的迁移和吞噬[20]，并激活一系列促炎细胞因子的产生和分泌，如TNF、IL-1、IL-6、IL-8，进而发挥炎症介质效应[4]。

另有研究表明，给予急性期脓毒症存活者抗HMGB1单克隆抗体对学习和记忆能力有显著的保护作用，而给予二硫化HMGB1可诱导认知障碍[21]。虽然二硫化HMGB1导致认知功能障碍的机制尚不明确，但这些结果已经提示二硫化HMGB1对发生认知功能衰退的脓毒症后遗症患者有神经性炎症致病作用，为在临床上应用HMGB1单克隆抗体以改善疾病预后提供了重要的实验依据。

2.1.2创伤 有研究证实，二硫化HMGB1是参与创伤后全身炎症的重要介质。重度创伤患者在创伤后3～6 h表达了第二个全身性HMGB1波峰，其中的二硫化HMGB1与全身炎症严重程度显著相关。这些结果为进一步探索二硫化HMGB1在创伤后炎症反应中的作用机制提供了实验基础，并为抑制二硫化HMGB1释放提供了时间窗[22]。

2.1.3药物性肝损伤 HMGB1与对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)中毒的发生机制有密切关系，HMGB1参与APAP所致的急性肝损伤在人类和动物模型中都有广泛研究[23,24]。Daniel等[23]为了解HMGB1的PTMs对APAP肝毒性的影响，首次在临床研究中对活化免疫细胞产生的血液循环乙酰化HMGB1进行了定性和定量分析。结果发现相比肝损伤患者血清总HMGB1的变化，血清乙酰化HMGB1仅在肝衰竭等预后差或死亡的患者中才升高。这表明，血乙酰化HMGB1的水平可能反映了肝炎症细胞浸润和活化的程度，而且比HMGB1更具有提示预后不良的特异性。

2.1.4缺血再灌注损伤 最近研究表明，HMGB1作为一种损伤相关模式分子，可在心脏、肝脏、肾脏、大脑等多个器官中引发缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤的炎症反应[13,25-27]。Tsung等[13]研究表明，细胞外的乙酰化、磷酸化和甲基化HMGB1可能通过刺激TNF和IL-6的生成触发肝脏I/R损伤的炎症反应。Liu等[28]研究却发现HMGB1的氧化修饰减弱了其在肝损伤过程的促炎活性，但该研究并未指出是HMGB1的部分氧化亦是完全氧化减弱了其促炎活性。而肝I/R损伤是一个以促炎活动为主的过程，是否乙酰化、磷酸化和甲基化HMGB1的促进炎症作用超越了氧化HMGB1的抑制炎症作用，尚待进一步研究。Yang等[29]研究提出β-石竹烯可通过抑制 HMGB1/ccTLR4/NK-κB通路减轻小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤，而二硫化HMGB1正是通过TLR4通路发挥促炎活性的。β-石竹烯是否通过抑制二硫化HMGB1减轻缺血再灌注损伤尚有待进一步研究。

2.1.5癫痫 HMGB1是致痫性损伤引起的无菌性神经炎的已知介质。Walker等[30]发现，在急性致痫性损伤动物模型的脑海马组织裂解物中，乙酰化HMGB1在癫痫持续状态后3 h至4 d内逐渐增加。HMGB1的氧化还原状态在癫痫形成过程中也发生了变化：在癫痫持续状态后第3小时，仅检测出完全还原化HMGB1的增加，但在6 h至4 d内，二硫化HMGB1也随完全还原化HMGB1一起增加，而磺化HMGB1在癫痫持续状态后的任何时间点均未检测到。在同一实验动物模型的血液中，乙酰化和二硫化HMGB1增加相对脑组织延迟了6小时以上，并且二硫化HMGB1也出现在完全还原化HMGB1增加之后。这些实验结果反映了在癫痫形成过程中HMGB1可能由脑脊液向血液转运，并且不同时间段的乙酰化和二硫化HMGB1的水平可能反映了致痫性损伤后细胞损伤的程度。

目前癫痫诊断后发作和复发的预后评估是基于年龄、发作类型、脑电图和磁共振成像等临床因素，但这缺乏精确性，联合检测脑脊液或血液中乙酰化和二硫化HMGB1的水平变化或许能使现有评估标准得到可观的改进。

2.2HMGB1翻译后修饰与自身免疫性疾病

2.2.1类风湿性关节炎 对幼年型类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)患者关节滑液的质谱分析表明[31]，滑膜巨噬细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞在滑膜组织中分泌了大量乙酰化HMGB1，以及有趋化作用和炎症因子诱导功能的完全还原化和二硫化HMGB1，而中性粒细胞在滑膜组织中释放的主要是单甲基化HMGB1，它们可能通过促进TNF、IL-1等炎症因子的产生而共同参与滑膜炎的发生。

2.2.2系统性红斑狼疮 系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)患者血浆中HMGB1水平升高并与疾病活动相关。磺化HMGB1丧失刺激细胞因子或诱导趋化的功能，相反它可诱导免疫耐受，虽然这与SLE以凋亡为中心的细胞死亡形式相符，却不符合SLE免疫性炎症的特点[32，33]。上述结论提示，除凋亡外，SLE的免疫性炎症过程还可能通过细胞焦亡或中性粒细胞胞外诱捕网等程序性细胞死亡方式导致细胞死亡，而这可能由具有免疫活性的完全还原化和二硫化HMGB1介导。然而，目前关于HMGB1亚型与SLE发病机制关系的研究甚少，这是值得我们进一步探索的问题。

2.2.3系统性硬化症 系统性硬化症(systemic sclerosis,SSc)典型病理过程是中性粒细胞介导的血管内皮细胞的激活和损伤。Norma等[34]研究发现，HMGB1氧化修饰影响着中性粒细胞的激活程度：中性粒细胞胞膜上髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的表达水平可反映其活化程度。而磺化HMGB1在诱导膜MPO表达上明显优于完全还原化HMGB1。这提示磺化HMGB1参与SSc的发病过程。

2.3HMGB1翻译后修饰与肿瘤 HMGB1在肿瘤发生发展中是一把双刃剑，起着致癌和抑癌的双重作用，这与HMGB1的定位和PTMs有着密切联系[35]。

2.3.1致癌作用 细胞外HMGB1通过多种受体，如晚期糖基化终产物受体(receptor of advanced glycation end product,RAGE)和TLR4，介导肿瘤微环境中细胞的相互作用，促进癌细胞的生长和扩散，包括维持炎症微环境[36-38]，补充代谢需要[35，39]，促进侵袭和转移[40]，抑制抗癌免疫[41]，促进血管生成[42,43]。二硫化HMGB1通过与RAGE结合诱导自噬，促进癌细胞的抗药性，从而促进癌症的发展[44]。

2.3.2抑癌作用 细胞核内HMGB1具有DNA伴侣活性的重要结构因子，HMGB1的缺失将导致基因组不稳定，端粒缩短。另外，HMGB1的缺失还会导致炎症和细胞器损伤，而这恰是癌症发生的主要驱动力[39,45]。与二硫化HMGB1相反，活性氧簇作用形成的磺化HMGB1增加了抗癌药物的细胞毒性，并通过线粒体途径诱导细胞凋亡，从而抑制癌症的发展[46]。这提示，阻断二硫化HMGB1释放和促进HMGB1的磺化可能对治疗癌症有帮助。

3 问题与展望

在生物学领域，HMGB1是罕见的具有丰富结构形式和功能的分子。HMGB1以其复杂多样的PTMs形成的不同亚型参与多种疾病的发生发展，它在癌症中的双相作用更是展现出其独特的生物学效应。然而HMGB1的PTMs在多大程度上影响着疾病的发生发展和预后，及其形成的不同亚型作为生物标志物的优势和局限性有待更进一步的研究。探索HMGB1亚型的功能多样性一直是医学研究的热点，也是开发新的抗炎和免疫抑制疗法的关键。