结直肠癌患者肿瘤组织浸润巨噬细胞PD-L1表达及其临床意义①

陆 峰 陈威鹏 颜 勋 于建秀 钱 雷③

(滨海县人民医院普外科，盐城 224500)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是最常见的具有高死亡率的恶性肿瘤之一，发病率在许多国家都在增加，每年在全世界范围内影响超过120万人[1]。患者肿瘤组织内含有较多肿瘤浸润免疫细胞，如T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK)和单核巨噬细胞，其中，巨噬细胞是肿瘤微环境中最丰富的免疫细胞群，作为先天免疫系统中的抗原呈递细胞，具有调节肿瘤组织内免疫细胞的功能[2]。巨噬细胞可通过表达程序性细胞死亡蛋白配体1(PD-L1)与T淋巴细胞表面程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)结合，抑制T淋巴细胞增殖和活化，导致T淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤作用下降，引起肿瘤细胞免疫逃逸[3]。研究表明，肿瘤浸润巨噬细胞与乳腺癌等肿瘤预后不良相关[4]，但结直肠癌肿瘤组织中巨噬细胞比例及其PD-L1表达，及其对T淋巴细胞增殖的影响缺乏研究，本研究通过检测结直肠癌肿瘤组织中巨噬细胞比例及其PD-L1表达，探讨其在结直肠癌中的作用。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1研究对象 选择2017年1月～2018年8月在滨海县人民医院住院结直肠癌患者26例，收集手术切除的组织标本，所有患者病理结果确诊为结直肠癌。分别取离体30 min内肿瘤边缘组织和距离肿瘤组织5 cm的相匹配的癌旁良性组织0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm作为癌组织和癌旁组织，立即放入装有4℃ 磷酸盐缓冲液(PBS)的保存管内。纳入标准：病例均为首次发现，术前未行任何放、化疗。排除标准：患者伴感染、自身免疫性疾病。患者年龄(62.9±5.3)岁，其中男性18例，女性8例。结肠癌13例，直肠癌13例；组织类型：管状腺癌20例，黏液腺癌6例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期8例，Ⅲ+Ⅳ期18例，该研究由滨海县人民医院伦理审查委员会批准，所有患者知情同意。

1.1.2仪器和试剂 人结肠癌细胞系SW480和单核细胞系THP-1购自上海生物细胞研究所；异硫氰酸荧光素(FITC)-鼠抗人CD3单克隆抗体(mAb)、藻红蛋白(PE)-鼠抗人CD4 mAb、叶绿素蛋白(PerCP)-cy5.5鼠抗人CD8 mAb、FITC-鼠抗人CD64 mAb、PE-鼠抗人CD11b mAb、PerCP-cy5.5鼠抗人PD-L1 mAb、PerCP-cy5.5鼠抗人CD163 mAb、别藻青蛋白(APC)鼠抗人-CD206 mAb和红细胞裂解液均为BD Biosciences产品；用于增殖测定的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)购自Thermo Fisher；胶原酶-P购自Sigma公司；细胞滤网购自美国BD Falcon公司；抗PD-1抗体购自Bristol-Myers Squibb公司；RPMI1640和DMEM细胞培养液购自Invitrogen公司；采用美国BD CantoⅡ流式细胞分析仪检测细胞表面标记。

1.2方法

1.2.1肿瘤浸润免疫细胞分离 根据文献[5]分离肿瘤浸润免疫细胞，将新鲜癌组织和癌旁组织在含有抗生素(庆大霉素和青霉素)的PBS中洗涤，用无菌手术刀机械解离组织，将样品切成约1 mm3的组织块，并在PBS中加入胶原酶P(1 mg/ml)酶促消化，在37℃、5%CO2轻轻摇动30 min。将上清液用70 μm细胞滤网过筛，用含10% 胎牛血清(FBS)和抗生素的DMEM培养液重悬细胞，终浓度为2×105个/ml。在完成分离方案后，立即荧光染色，流式细胞术分析细胞表面标志。

1.2.2巨噬细胞诱导及单个核细胞分离 先将单核细胞系THP-1诱导分化为巨噬细胞，将THP-1细胞接种在24孔板(5×105个/孔)，在RPMI1640培养基中加入佛波酯(100 ng/ml)刺激培养24 h，悬浮的单核细胞分化为贴壁生长的巨噬细胞。采用Ficoll-Hypaque密度离心法获得健康体检者外周血单个核细胞(PBMC)，用RPMI1640培养基重悬，浓度为2×105个/ml，接种于24孔板。

1.2.3细胞共培养体系 人结肠癌细胞系SW480在DMEM培养基中培养，接种于6孔细胞培养板(5×105个/孔)，分别将巨噬细胞(2.5×105个/室)和单个核细胞(2.5×105个/室)接种于Transwell小室，然后将Transwell小室置于6孔板上，建立非接触共培养体系，在37℃和5%CO2下共孵育5 d(共培养组)，以不含人结肠癌细胞的巨噬细胞和单个核细胞的共培养体系为空白对照组。收集共培养细胞,PBS洗涤后,根据 CD64+CD11b+阳性选取巨噬细胞,然后流式细胞术检测CD163、CD206及PD-L1阳性细胞比例；根据CD3选取淋巴细胞，检测CD4+,CD8+T细胞表面PD-1阳性率。

1.2.4流式细胞术检测 取100 μl巨噬细胞和/或单个核细胞悬液，加入10 μl FITC-鼠抗人CD3 mAb、10 μl PE-鼠抗人CD4 mAb、10 μl PerCP-cy5.5鼠抗人CD8 mAb及APC-鼠抗人PD-1 mAb；取100 μl 细胞悬液，加入10 μl FITC-鼠抗人CD64 mAb、10 μl PE-鼠抗人CD11b mAb、10 μl PerCP-cy5.5鼠抗人PD-L1 mAb、或10 μl PerCP-cy5.5鼠抗人CD163 mAb、或10 μl APC鼠抗人-CD206 mAb标记细胞，并在4℃下黑暗中孵育30 min，然后用PBS洗涤并重悬。同时用匹配的同种型抗体用作阴性对照。使用流式细胞仪分析细胞表面标记。根据肠道巨噬细胞表面CD64+CD11b+表达，检测组织中巨噬细胞比例[6]。

1.2.5增殖试验 PBMC、巨噬细胞与人结肠癌细胞系SW480共培养，用不含有肿瘤细胞的培养体系作对照组，加入终浓度为5 μg/ml抗-PD-1抗体阻断PD-L1/PD-1相互作用，在37℃和5%CO2下共孵育5 d。此后用CFSE-FITC对细胞进行荧光染色，通过流式细胞术检测增殖。

2 结果

2.1流式细胞术检测结直肠癌组织中免疫细胞比例 与癌旁组织相比，肿瘤组织中巨噬细胞和CD4+/CD3+T细胞比例显著上升，CD8+/CD3+T细胞比例显著下降，差异均有统计学意义(P<0.05)，结果见表1。

2.2结直肠癌组织巨噬细胞表面分子检测 根据CD64+CD11b+阳性选取巨噬细胞，然后检测其表面PD-L1、CD206和CD163表达(图1)。与癌旁组织相比，结直肠癌组织浸润巨噬细胞PD-L1、CD206和CD163阳性细胞比例显著上升，差异均有统计学意义(P<0.05)，结果见表2。

表1 结直肠癌与癌旁组织浸润细胞比较

Tab.1 Comparison of infiltrating cells between colorectal cancer and adjacent tissues

GroupsnMacrophages(%)CD4+/CD3+T cell(%)CD8+/CD3+T cell(%)Cancer tissue265.6±0.61)20.9±6.41)4.6±1.71)Paracancerous tissue260.9±0.30.8±0.341.4±10.5 t35.7215.9917.64P<0.001<0.001<0.001

Note：Cancer tissue vs paracancerous tissue，1)P<0.05.

图1 流式细胞术检测结直肠癌患者巨噬细胞分子的表达Fig.1 Analysis of molecules expression on macrophages in colorectal cancer by flow cytometryNote: A.Percentage of PD-L1 positive macrophage;B.Percentage of CD206 positive macrophage;C.Percentage of CD163 positive macrophage.

表2 结直肠癌与癌旁组织浸润巨噬细胞表面分子比较

Tab.2 Comparison of molecules expression on macropha-ges between colorectal cancer and adjacent tissues

GroupsnPD-L1(%)CD206(%)CD163(%)Cancer tissue2613.6±2.61)12.9±2.41)14.6±2.71)Paracancerous tissue262.9±0.72.8±0.8 2.4±0.8 t20.2620.3522.09P<0.001<0.001<0.001

Note：Vs paracancerous tissue，1)P<0.05.

2.3与结肠癌细胞共培养的单核巨噬细胞表面分子表达 与对照组相比，与结肠癌细胞共培养的巨噬细胞表面PD-L1、CD206和CD163表达显著上升，差异均有统计学意义(P<0.05)，结果见表3。

2.4与结肠癌细胞共培养的淋巴细胞表面PD-1检测 与对照组相比，与结肠癌细胞共培养的淋巴细胞表面PD-1表达显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)，结果见表4。

2.5与结肠癌细胞和巨噬细胞共培养的淋巴细胞增殖检测 与空白对照组相比，与结肠癌SW480细胞和巨噬细胞共培养的淋巴细胞增殖率显著下降，与结肠癌SW480细胞共培养组相比，抗-PD-1对照组淋巴细胞增殖率显著上升，差异均有统计学意义(P<0.05)，结果见表5。

表3 与结肠癌细胞共培养巨噬细胞表面分子表达

Tab.3 Molecules expression on macrophage surface co-cultured with colon cancer cells

GroupsPD-L1(%)CD206(%)CD163(%)Co-culture group14.2±2.11)32.6±6.51)35.1±5.81)Control group6.3±1.412.9±3.320.2±4.6t15.9613.7710.26P<0.001<0.001<0.001

Note：Vs control group，1)P<0.05.

表4 共培养的淋巴细胞表面PD-1阳性率比较

Tab.4 Percentage of PD-1 positive lymphocytes co-cultured with colon cancer cells

GroupsCD4+T cell PD-1(%)CD8+T cell PD-1(%)Co-culture group4.7±2.51)2.8±0.61)Control group1.5±0.51.1±0.3t6.4012.92P<0.001<0.001

Note：Vs control group,1)P<0.05.

表5 共培养的淋巴细胞增殖率比较

Tab.5 Proliferative rates of lymphocyte co-cultured with macrophage and SW480 cells

GroupsCD4+T cell(%)CD8+T cell(%)Control group28.5±7.51)26.3±4.51)Co-culture group13.3±2.214.4±2.5Co-culture group+Anti-PD-123.1±5.22)21.2±2.42)F56.461.2P<0.001<0.001

Note：Vs co-culture group，1)P<0.05；vs co-culture group，2)P<0.05.

3 讨论

机体免疫系统与肿瘤细胞之间的相互作用在肿瘤进展中起着重要作用，肿瘤的免疫编辑理论认为，在肿瘤细胞逃逸期，肿瘤快速生长形成一个抑制免疫细胞的微环境。在此微环境中，可识别并消除肿瘤细胞的CD8+T细胞和NK细胞等，细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)功能受损，在体外分离和培养时增殖能力和细胞因子分泌功能降低[7]，另一方面，调节性T细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、肿瘤相关粒细胞和髓系来源抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)可促进癌细胞的增殖和转移[8]。TAM分泌高水平的IL-10和低水平的IL-12，促进血管的生成、肿瘤的侵袭和转移。因此，通过癌症疫苗接种、免疫检查点治疗和过继性CTL转移治疗等免疫疗法可调节肿瘤组织浸润免疫细胞的功能，最大化CTL的杀肿瘤能力，抑制TAM等的促肿瘤作用。

肿瘤浸润性免疫细胞是肿瘤免疫微环境的重要组织部分，代表了宿主对肿瘤免疫应答的状态。本次研究证实，与癌旁组织相比，肿瘤组织中巨噬细胞和CD4+/CD3+T细胞比例显著上升，CD8+/CD3+T细胞比例显著下降。肿瘤相关巨噬细胞是实体肿瘤中最丰富的细胞类型，其向肿瘤的浸润与大多数实体瘤的预后不良有关[9]。Galon等[10]研究表明，原发性结直肠癌肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞比例降低与肿瘤侵袭性和分期增加有关，患者存活率下降，临床预后不良。卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和胆道癌的不良预后也与肿瘤浸润低比例的CD8+T细胞相关[11]。上述结果表明，淋巴细胞和巨噬细胞作为宿主防御的第一线，通过识别和响应肿瘤细胞，在结直肠癌的进展中起重要作用。

巨噬细胞是一类极具异质性的细胞群体，在体内外不同的微环境下，表现出独特的表型，并具有功能的差异。根据功能的差异，巨噬细胞主要分为经典型(M1)或替代型(M2)。M1巨噬细胞负责促进炎症、抗肿瘤和免疫反应，M2巨噬细胞也称为肿瘤相关巨噬细胞，参与肿瘤血管生成[12]。TAMs来源于循环单核细胞，由肿瘤细胞分泌的单核细胞趋化因子CCL2/MCP-1募集到肿瘤部位，肿瘤细胞通过分泌肿瘤细胞因子和前列腺素等多种机制抑制巨噬细胞的抗肿瘤作用[13]。本次研究通过流式细胞术验证，肿瘤浸润的单核巨噬细胞高表达CD163和CD206，呈M2极化。Li等[14]研究证实高比例的M2巨噬细胞极化与结直肠癌患者预后不良密切相关。

本研究还发现，肿瘤浸润的巨噬细胞高表达PD-L1。在特异性免疫应答中，巨噬细胞表面PD-L1与T细胞表面免疫检查点PD-1受体结合，通过传递的内在负调节机制，诱导效应T细胞凋亡，抑制其发挥抗肿瘤作用[15]。本次研究通过体外实验也证实，与结肠癌肿瘤细胞共培养的巨噬细胞表面PD-L1 表达上升。肿瘤细胞会释放一些具有免疫抑制功能的分子，如TGF-β、IL-10等，并能诱导调节T细胞表达细胞毒T淋巴细胞相关抗原(CTLA-4)，诱导T淋巴细胞无反应性，导致免疫系统产生对肿瘤的免疫耐受[16]。

巨噬细胞作为抗原提呈细胞，还参与适应性免疫应答，通过表达PD-L1与T细胞表面PD-1结合，抑制T细胞功能。从小鼠和人类实体肿瘤分离的巨噬细胞在体外可直接抑制T细胞反应和NK细胞的细胞毒性[17]。本次研究证实，与结肠癌肿瘤细胞和巨噬细胞共培养的淋巴细胞增殖下降，此抑制作用可被抗-PD-1抗体部份阻断，表明巨噬细胞通过高表达PD-L1与PD-1+T细胞相互作用。与此一致的是，Wu等[18]证实结直肠癌肿瘤浸润淋巴结中CD8+T细胞的PD-1表达显著上调，产生细胞因子(IL-2和IFN-γ)和穿孔素功能力下降。在乳腺癌小鼠模型中，去除TAM增强了CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫力[19]，TAM与肿瘤细胞浸润CD8+T细胞的物理接触抑制了T细胞的完全活化并阻止其进入肿瘤细胞[20]，因此，抑制TAM是提高免疫疗法疗效的重要方法[21]。

综上所述，本研究表明结直肠癌肿瘤组织中存在高比例的巨噬细胞，CD8+/CD3+T淋巴细胞比例降低，且巨噬细胞高表达PD-L1，淋巴细胞高表达PD-1。通过体外实验证实，肿瘤微环境可诱导巨噬细胞PD-L1和淋巴细胞PD-1表达，巨噬细胞通过PD-L1与PD-1+T细胞相互作用抑制T细胞增殖，从而降低T细胞免疫功能，可能在肿瘤细胞免疫逃逸过程中发挥作用。因此对肿瘤微环境中巨噬细胞极化状态和PD-1/PD-L1信号通路的抑制对于CRC的治疗具有重要的作用。