虾青素对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的降脂、抗氧化和抗炎作用研究

张克连 郭静宜 戴若竹

(福建省泉州市第一医院心血管内科，泉州 362000)

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是多种心脑血管疾病共同的病理学基础。由AS导致的心肌梗死、脑中风等疾病已成为严重危害人类健康的主要疾病之一，给社会和家庭带来沉重负担，近些年AS的发病率越来越高，且呈年轻化趋势，因此控制AS的发生发展对预防和治疗心脑血管系统疾病尤为重要。大量研究表明，胆固醇可能参与了AS的发生和发展，低密度脂蛋白及其氧化型能增加动脉壁胆固醇内流和沉积，促进AS形成；相反，高密度脂蛋白和氧化型高密度脂蛋白则通过抑制固醇内流和沉积，从而阻止AS的发生发展[1]。研究也表明，炎症是AS的重要特征和启动因子，它导致血管中的中性粒细胞和单核细胞浸润，从而促进脂质沉积。在AS的发展中，IL-6、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)等炎症因子发挥着重要作用[2,3]。

低密度脂蛋白的氧化假说给AS的抗氧化治疗提供了理论依据。许多抗氧化性物质用于阻滞动脉粥样硬化的发生和发展研究[4,5]。虾青素(astaxanthin)是一种类胡萝卜素，是最强的天然抗氧化剂之一，能有效清除细胞内的氧自由基，增强细胞再生能力，除此之外还能增强免疫力，预防心脑血管疾病[6]。本研究应用ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠建立AS模型，采用虾青素进行干预，研究虾青素在降低脂质，对抗氧化、炎症因子和血小板聚集等方面对AS产生的保护效应。

1 材料与方法

1.1材料 虾青素(≥95%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)试剂盒(上海信裕生物科技有限公司)；总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、总超氧化物歧化酶(total superoxide disumutase,T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；小鼠IL-6、小鼠MCP-1和小鼠超敏C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)。

雄性ApoE-/-小鼠，体质量(20±2)g(北京大学动物实验中心,SPF级，实验动物生产许可证号：SCXR(京)2014-0004，合格证号:11401300034676)。

Synergy2 多功能酶标仪(美国伯腾公司)，高速离心机(美国Sigma公司)，全自动生化检查仪，血糖监测仪，光学显微镜(日本Olympus公司)，凝聚计(美国Chrono-log公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠的饲养 取小鼠40只单独喂养，随机分为4组：正常组(10只)、高脂组(10只)，虾青素低剂量组(10只)和虾青素高剂量组(10只)。正常组自由摄入普通饲料和水，高脂组和虾青素治疗组均给予高脂饮食(含有75%普通饲料，10%猪油、0.3%胆酸和15%蛋黄粉)喂养。将虾青素与0.5%蔗糖酯水溶液混合制成混悬液，每天经口灌胃给药0.2 ml，低和高剂量分别为50 mg/kg和150 mg/kg，模型组和正常组每天给予0.2 ml 0.25%蔗糖酯水溶液。于实验开始时，定期对小鼠进行称重。每2日更换垫料，添加1次食物，喂养时间150 d。

1.2.2血脂和血糖指标的测定 于喂养后50 d、100 d 和150 d，禁食12 h，穿刺眼球后静脉丛取血0.4～0.5 ml，3 000 g离心10 min，取血清，采用全自动生化检查仪检测TC、TG、LDL-C和HDL-C水平，采用血糖监测仪测定血糖水平。

1.2.3氧化指标的测定 取1.2.2项下喂养150 d的各组小鼠的血清，分别采用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)、ABTS法、比色法和硫代巴比妥酸法检测T-SOD、T-AOC、GSH-Px和MDA水平。

1.2.4炎症因子的测定 取1.2.2项下喂养150 d的各组小鼠的血清，按照ELISA试剂盒的说明书操作，测定血浆中炎症因子IL-6、CRP和MCP-1的水平。

1.2.5血小板聚集 取1.2.2项下喂养150 d的各组小鼠的全血0.5 ml，置于3.2%柠檬酸盐缓冲液中，按照文献[7]于37℃下(采用2-通道凝集计)进行光学血小板聚集试验，5 min左右会出现最大聚集，作为聚集度的测定值。

1.2.6主动脉取材及斑块分析 取喂养150 d的各组小鼠，2%戊巴比妥麻醉小鼠，快速取出自心脏始发1～2 mm处主动脉。主动脉用生理盐水灌流，放置于多聚甲醛中固定，过夜后转入20%蔗糖溶液脱水。取脱水后的主动脉，纵向剖开，量取油红O液染色1 h，用60%异丙醇浸泡标本至斑块底色为白色。蒸馏水清洗后将主动脉于黑色硅胶垫上平铺固定，镜检拍照，用Image J软件记录并分析测量斑块面积，以斑块面积占主动脉内膜总面积的百分比数作为斑块大小的评价指标。

用OCT包埋整个主动脉根本，并用液氮快速冷冻，进行冷冻切片，切片厚度为7 μm，对每一根胸主动脉至少进行5个横剖面的分析。用于油红O染色的切片恢复室温后使用蒸馏水润洗,后置于100%丙二醇溶液脱水2 min，用油红O工作液室温下染色1 h，镜检拍照。

2 结果

2.1虾青素对小鼠体重的影响 各组小鼠饮食正常，毛被正常，体重稳定增加，未出现死亡情况和疾病异常。高脂组小鼠体重增幅最大，与正常组小鼠体重相比差异有统计学意义(P<0.05)，虾青素低剂量组和高剂量组体重增幅略低于高脂组，但差异无统计学意义(P>0.05)，提示虾青素对小鼠无毒副作用，对小鼠体重的增长无显著影响，见图1。

2.2生化指标分析

2.2.1虾青素对血脂和血糖的影响 与正常组比，高脂组血清中TC、TG、LDL-C和血糖水平都显著升高(P<0.05)，HDL-C显著降低(P<0.05)。与高脂组比较，虾青素组血清中TC、TG、LDL-C和血糖水平均显著降低(P<0.05)，HDL-C显著增高(P<0.05)，且呈剂量依赖性趋势，见图2。

2.2.2虾青素对血清中的T-SOD、T-AOC、MDA和GSH-Px水平的影响 与正常组比，高脂组的T-SOD、T-AOC和GSH-Px明显降低(P<0.01)，MDA明显增高(P<0.01)，与高脂组比，虾青素组的T-SOD、T-AOC和GSH-Px均有不同程度地升高(P<0.05)，MDA不同程度地降低(P<0.05)，呈剂量依赖性趋势，见表1。

2.2.3虾青素对血清中的炎症因子MCP-1、CRP和IL-6的影响 与正常组比，高脂组MCP-1、CRP和IL-6水平均显著增高(P<0.01)，与高脂组比，虾青素组的MCP-1、CRP和IL-6水平均明显降低(P<0.01)，呈剂量依赖性趋势，见图3。

2.3虾青素对动脉硬化斑块的影响 正常组血管管壁较光滑，内膜无明显增厚，未见明显斑块形成，斑块面积占主动脉内膜总面积的百分比为(13.14±0.61)%。高脂组小鼠主动脉血管壁染色层明显增厚，而且厚薄不均匀无规则，内皮有部分脱落现象，这说明脂质累积成为脂质池，有大量的泡沫细胞和炎症细胞浸润血管，使管内形成明显的斑块，斑块面积占主动脉内膜总面积的百分比为(41.23±6.57)%，与正常组比明显增高(P<0.01)。与高脂组比，虾青素高(30.14±5.47)%和低剂量(28.71±4.2)%组斑块面积占主动脉内膜总面积的百分比数明显降低(P<0.05)，见图4。

2.4虾青素对血小板聚集的抑制作用 高脂组、虾青素高剂量组及虾青素低剂量组的血小板聚集度分别为(40.6±1.6)%、(29.4±3.1)%和(15.4±4.2)%，与高脂组相比，虾青素组血小板聚集度明显降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性趋势。

图1 虾青素对小鼠体重增长的影响Fig.1 Effect of astaxanthin on body weight of mice

图2 不同时间各组ApoE-/-小鼠的TC、TG、LDL-C、HDL-C和血糖水平Fig.2 Comparison of TC,TG,LDL-C,HDL-C and blood glucose of different groups of AopE-/- mice in different timeNote: Compared with the normal group,#.P<0.01;compared with the high fat group,△.P<0.05,*.P<0.01.

表1 各组ApoE-/-小鼠血清中的T-SOD、T-AOC、MDA和GSH-Px的水平

Tab.1 Comparison of T-SOD，T-AOC，MDA and GSH-Px level of different groups of ApoE-/-mice

GroupsT-SOD(U/ml)T-AOC(U/ml)MDA(nmol/ml)GSH-Px(U/ml)Normal135.26±3.653.18±0.6231.93±2.98210.25±4.13High fat90.31±9.611)1.42±0.871)56.54±5.251)155.38±2.491)Astaxanthin low dose132.35±5.573)2.29±0.972)30.12±4.573)248.27±4.513)Astaxanthin high dose144.12±3.693)3.61±0.293)28.09±6.123)310.21±5.793)

Note：Compared with the normal group,1)P<0.01；compared with the high fat group,2)P<0.05,3)P<0.01.

图3 各组ApoE-/-小鼠的炎症因子Fig.3 Comparison of inflammatory factors of different groupsNote: Compared with the normal group,#.P<0.01；compared with the high fat group,*.P<0.01.

图4 不同组ApoE-/-鼠胸主动脉病理图Fig.4 Histomorhologic changes in aorta of different groups

3 讨论

研究表明，动物高脂喂养后，其血清中TC、TG和LDL-C等水平明显升高，HDL-C水平降低。经过长时间高脂喂养的ApoE-/-小鼠在动脉上能形成AS脂质斑块，为此建立了实验用的AS模型。人类长期食用高脂高糖膳食也会造成血脂异常和血管硬化[8]。本研究用虾青素干预高脂喂养的小鼠，扭转了TC、TG、LDL-C及血糖水平缓慢升高的趋势，而且使其各指标降低。高剂量组指标降低更显著，说明具有剂量依赖性。HDL-C将血管床中多余的胆固醇转运至肝脏后由胆汁排出体外。HDL-C的升高会有助于TC的降低。

LDL-C氧化修饰被认为是AS形成的关键启动因素。氧化低密度脂蛋白(oxLDL-C)具有细胞毒性，能引起血管内皮细胞功能和结构的改变，例如内皮细胞变性、坏死或者脱落，破坏内皮细胞完整性。血液中的单核细胞及LDL通过损伤的血管内皮进入内膜下，加速脂质条纹的形成。oxLDL也是刺激内皮细胞和单核细胞/巨噬细胞分泌多种炎症的因子。oxLDL能够上调巨噬细胞表明的清道夫受体数量并被过度摄取，导致胞内大量胆固醇聚集进而形成泡沫细胞，大量泡沫细胞停留在血管壁内，使AS斑块形成[9]。通过观察小鼠AS斑块发现，确实存在碎片脱落和脂质堆积结构中间空隙较大现象，这可能与oxLDL能够改变血管内皮细胞结构有关。

虾青素是一种具有强大抗氧化特性的类胡萝卜素，其抗氧化活性是维生素E的550倍,是β-胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素和角黄素等类胡萝卜素的10倍，被誉为“超级抗氧化剂”。在提高免疫力、抗癌抗肿瘤、保护眼睛和中枢神经系统、延缓衰老等方面具有积极的促进作用。机体的氧化应激是指由于自由基过量生成和/或细胞内抗氧化防御系统受损，导致氧自由基及其相关代谢产物过量聚集，从而对细胞产生多重毒性作用的病理状态。人体很多疾病(比如心脏病、糖尿病、关节炎、癌症和心脑血管疾病等)的发生和发展与自由基参与的氧化作用有关[10]。T-AOC是反映机体整体抗氧化水平的重要指标。SOD为酶型抗氧化物质，能清除超氧阴离子。MAD是脂质过氧化反应的代谢产物，MDA的测定常常与SOD的测定相互配合，SOD活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度，是反映氧化应激较好的指标[9]。当机体细胞受到氧化自由基攻击后，会引发脂质的过氧化作用，从而促使MDA的产生。所以血清中MDA的含量可以反映机体的氧化情况[10]。研究检测血清中T-AOC、SOD、MDA和GSH-Px水平，高脂组小鼠的T-AOC、SOD和GSH-Px水平下降明显，而MDA水平明显提高。表明高脂饮食诱导了脂质过氧化物，从而使机体的抗氧化防御机制受损，而虾青素的干预能明显改善实验小鼠的抗氧化能力。

炎症因子研究结果表明，虾青素干预高脂喂养的ApoE-/-小鼠，能显著降低血清中的炎症因子IL-6、MCP-1和CRP水平，而且高剂量组降低更明显，说明虾青素对AS的ApoE-/-小鼠具有抗炎作用且有剂量依赖性。AS具有慢性炎症反应特征的病理过程，而且AS从粥样硬化斑块形成到斑块破裂，以及血栓形成的各个阶段都少不得炎症细胞和炎症介质的参与。IL-6由纤维细胞、单核细胞和T细胞等分泌，可通过诱导血小板源生长因子促进血管平滑肌增殖，从而促进AS的进程。IL-6为调节体内免疫功能和代谢过程的细胞因子，在动脉粥样硬化斑块的肩区表达,通过刺激 MMP、MCP-1和TNF-α表达导致斑块不稳定。在AS斑块的CRP是反映感染和疗效的指标，水平高表明机体炎症水平高。有研究表明，绝大部分心肌梗死患者CRP水平都很高。临床已经将CRP水平用于预测心脑血管疾病的发生风险[2]。单核细胞黏附于血管壁并进入内皮细胞形成泡沫细胞是AS早期病变。大量研究表明单核细胞趋化主要由MCP-1实现，临床冠状AS的MCP-1水平也增高[3]。

血小板不仅能促进血栓形成，而且还是炎症和动脉粥样硬化的重要关联体。血小板可能激活炎症反应、释放细胞因子，介导内皮黏附以及相关脂蛋白的调节作用。研究表明高脂血症患者的β-血小板球蛋白及血小板因子含量增加，血小板聚集性增强，表明高脂血症患者的血小板活化加强[11]。体外实验证明，高脂血症患者血小板比正常人血小板对促聚集剂更敏感。LDL-C能增加ADP诱导的纤维蛋白原与血小板的结合，其增强作用与LDL之间呈剂量依赖关系，通过这种增强作用，LDL能加快血小板的聚集，而oxLDL增加血小板聚集的作用更强[12]。研究发现，虾青素干预组血小板聚集明显降低，这可能与虾青素降低LDL和oxLDL有关系。