菖蒲四逆散干预AD模型大鼠Aβ代谢的级联靶效

邢喜平 王虎平 (甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 73000；甘肃中医药大学)

在世界各国人口老龄化的快速推进，阿尔茨海默病(AD)已严重影响着老年人的生活质量和生命健康〔1〕。因此，AD发病机制、治则治法、药物开发已成为世界医学的研究热点。前期我们基于“从肝脾论治AD”〔2〕的科研假说开展了逍遥散、黑逍遥散干预AD的相关实验〔1，3～16〕并取得了一定的进展。本研究将从追本溯源、精简配伍的角度基于干预β-淀粉样蛋白(Aβ)代谢的级联靶效探讨菖蒲四逆散对AD模型大鼠自由基氧化、胆碱神经递质、学习记忆的影响。

1 材料与方法

1.1主要材料 70只3月龄SPF级Wistar大鼠，雌、雄各半，体重(200±20)g，由兰州畜医研究所实验动物场提供，许可证号：SCXK(甘)2015-0001；菖蒲四逆散各组成药物(石菖蒲、柴胡、白芍、枳实、甘草)、青霉素(160万U，批号：F6057301，华北制药股份有限公司)、盐酸多奈哌齐(批号：1604043，卫材(中国)药业有限公司)均购自甘肃中医药大学附属医院；Aβ25～35(批号：20160509)购于上海强耀生物科技有限公司；Rat淀粉样前体蛋白(APP)酶联免疫吸附试验(ELISA)KIT(批号：1069820)、Rat Aβ1～42ELISA KIT(批号：1069821)、Rat乙酰胆碱(Ach)ELISA KIT(批号：1069818)、Rat胆碱乙酰转移酶(ChAT)ELISA KIT(批号：1069819)均购自上海酶联生物科技有限公司；乙酰胆碱酯酶(AChE)试剂盒(批号：20161218)、丙二醛(MDA)试剂盒(批号：20161221)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号：20161221)、考马斯亮兰蛋白测试盒(批号：20161220)均购自南京建成生物化学试剂有限公司；大鼠脑立体定位仪(型号：WT-200)、Morris水迷宫视频跟踪系统(型号：WMT-100)均为成都泰盟科技有限公司提供；酶标分析仪(型号：DNM-9602)，北京普朗新技术有限公司；紫外分光光度计(型号：UV-120-02)，日本岛津。

1.2动物分组与造模 70只SPF级Wistar大鼠(雌雄各半)于SPF级实验室适应性喂养3 d后水迷宫测试学习记忆能力，剔除不合格大鼠。合格大鼠以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，并按《大鼠脑立体定位图谱》〔17〕进行海马CA1区注射，其中随机选取10只大鼠设为假手术组注射生理盐水2 μl，其余皆注射Aβ25～35溶液(浓度为10 μg/μl)2 μl造模。术后碘伏擦拭伤口、涂青霉素粉末10万U并每天肌肉注射青霉素10万U，连续7 d。第8天以水迷宫测试造模大鼠学习记忆能力，筛选造模成功的50只大鼠随机分为模型组、菖蒲四逆散低、中、高剂量组、阳性药组各10只。

1.3药物配制与给药 菖蒲四逆散各组大鼠对应生药量以《方剂学》〔18〕中四逆散(柴胡、白芍、枳实、甘草各6g)和《中药学》〔19〕中石菖蒲(10 g)的常用剂量作为成年人中剂量、2倍为高剂量、1/2为低剂量换算得到，分别为0.34、0.68、0.17 g/(100 g·d)，灌胃水煎液皆浓缩为2 ml/(100 g·d)。

阳性药组：安理申以蒸馏水配制成浓度为0.045 mg/ml的溶液。

造模第7 d开始给药干预，模型组与假手术组大鼠灌胃生理盐水2 ml/(100 g·d)，菖蒲四逆散低、中、高剂量组及阳性药组大鼠分别灌胃各组对应药液2 ml/(100 g·d)，连续28 d。

1.4Morris水迷宫测试学习记忆〔1〕

1.4.1定位航行实验 Morris水迷宫分为四个象限，逃生平台放置于固定象限。测试时将大鼠从各象限的固定入水点放入，其入水后寻找到平台的时间即为逃避潜伏期。若在2 min内没有找到平台，则记为120 s。共历时4 d，每天更换入水象限测试。

1.4.2空间探索实验 迷宫实验第5天撤走逃生平台，任选1个象限放入大鼠，让其凭记忆寻找原逃生平台位置。记录其首次经过原平台位置的潜伏时间及120 s内穿越原平台的次数，计算分析其在原平台象限的游泳时间百分比。

1.5SOD、MDA、Ach、ChAT、AchE、APP、Aβ1～42测定 腹主动脉采血并分离血清，比色法测定血清SOD、AchE活性及MDA水平，ELISA测定血清Ach含量及 ChAT活性；分离脑组织海马并加生理盐水制成10%的匀浆，ELISA测定海马匀浆APP、Aβ1～42含量。

1.6统计学方法 采用SPSS20.0软件进行方差分析，t检验。

2 结 果

2.1动物死亡情况 28 d给药干预中，模型组、假手术组各死亡2只，阳性药组死亡3只，菖蒲四逆散低剂量组死亡2只，高剂量组死亡1只。

2.2Morris水迷宫定位航行实验 与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长，在目标象限滞留时间百分比明显减少(P<0.01)；与模型组相比，阳性药组、菖蒲四逆散各组大鼠逃避潜伏期均明显缩短(P<0.05，P<0.01)，高剂量组明显优于低、中剂量组(P<0.05)；在目标象限滞留时间百分比均明显延长(P<0.05，P<0.01)，中、高剂量组明显优于低剂量组(P<0.05)。见表1。

表1 各组逃避潜伏期、在目标象限滞留时间百分比、首次到达原平台位置潜伏期

与模型组相比：1)P<0.05，2)P<0.01；与高剂量组相比：3)P<0.05，4)P<0.01；与中剂量组比较：5)P<0.05；下表同

2.3Morris水迷宫空间探索实验 与假手术组比较，模型组大鼠首次到达原逃生平台位置的潜伏时间明显延长，穿越原逃生平台位置次数较少，在目标象限滞留时间百分比明显减少(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组、菖蒲四逆散各剂量组大鼠首次到达原平台位置的潜伏期明显缩短、穿越原平台位置的次数均明显提升，在目标象限滞留时间百分比均明显增多(P<0.01)，且中、高剂量组在目标象限滞留时间百分比明显优于低剂量组(P<0.05)。见表2。

组别n首次到达原平台位置潜伏期(s)穿越原平台位置次数(次)在目标象限滞留时间百分比(%)模型组837.62±19.131.75±1.3919.54±5.31假手术组817.32±1.982)4.63±1.772)40.30±10.482)阳性药组719.42±4.791)4.14±1.072)40.02±8.162)菖蒲四逆散 低剂量组822.55±9.341)3.57±1.242)27.34±9.301)3)5) 中剂量组1023.03±5.371)3.26±1.112)38.85±9.742) 高剂量组921.45±8.561)4.08±1.372)39.08±10.212)

2.4对AD模型大鼠海马APP、Aβ1～42含量的影响 与假手术组比较，模型组大鼠海马APP、Aβ1～42含量明显升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组、菖蒲四逆散各组大鼠海马组织Aβ1～42、APP含量明显降低(P<0.05，P<0.01)。见表3。

2.5对AD模型大鼠血清SOD活性、MDA水平的影响 与假手术组相比，模型组大鼠血清SOD活性显著降低，MDA水平明显增高(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组、菖蒲四逆散各剂量组大鼠血清SOD活性增强，MDA水平明显降低(P<0.05,P<0.01)，且高剂量组大鼠MDA水平明显低于中、低剂量组(P<0.01)。见表3。

2.6对AD模型大鼠血清Ach水平与ChAT、AchE活性的影响 与假手术组相比，模型组大鼠血清Ach水平与ChAT活性明显降低，AchE活性明显增强(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组、菖蒲四逆散各剂量组大鼠血清Ach含量明显提高，ChAT活性明显增强，AchE活性明显减弱(P<0.05，P<0.01)。见表3。

组别nAPP(pg/mg)Aβ1～42(pg/mg)Ach(mmol/L)ChAT(U/ml)AchE(U/ml)SOD(U/ml)MDA(nmol/ml)模型组885.52±12.74141.32±23.523.63±0.34220.38±31.648.98±1.4344.86±8.076.67±0.84假手术组840.13±8.222)78.53±17.552)8.21±0.562)316.40±40.252)6.29±1.752)112.31±5.842)3.60±0.332)阳性药组748.33±9.872)82.40±16.982)6.16±0.392)281.91±19.421)6.17±1.562)80.77±9.802)4.55±0.902)菖蒲四逆散 低剂量组861.08±11.421)3)92.13±18.482)4.27±0.531)3)278.35±29.521)6.88±1.421)3)76.24±9.031)6.15±0.581)4) 中剂量组1049.34±9.522)85.42±16.912)6.12±0.592)259.28±24.741)3)6.12±1.412)79.42±9.521)6.21±0.651)4) 高剂量组943.51±10.242)96.19±15.732)7.95±0.522)294.25±20.532)6.24±1.312)88.91±10.332)4.21±0.522)

3 讨 论

AD与中医 “痴呆”、“呆门”、“呆病”等密切相关，常规认为其本在肾，以肾精亏虚，髓海不足为主。而《素问·灵兰秘典论》云：“肝者，将军之官，谋虑出焉”，《素问·六节藏象论》云：“肝者，罢极之本，魂之居也。”《难经》云：“脾藏意与智”，《医方类聚》云：“脾藏二神意与智，意不安，思无虑，神夺愚也”。可见，AD与肝、脾关系密切，调和肝脾将是防治AD的重要思路〔2〕。

四逆散作为调和肝脾的基础方，方中柴胡疏肝解郁，白芍养血柔肝，和里暖急，二药相合，一气一血，一散一收，补肝体而助肝用；枳实苦泄，理脾导滞，与柴胡相配，一肝一脾，一升一降，调肝脾而畅气机；甘草益气和中，调和诸药。全方柴胡、芍药以治肝，枳实、甘草以治脾，四药相配，疏理肝脾，宁魂益智。石菖蒲“开心孔，补五脏，通九窍，明耳目，出音声”，使人“不忘，不迷惑”。如此配伍的菖蒲四逆散肝脾同调，邪正兼顾，则心启窍开，耳聪目明，神魂自如，痴呆自除。

现代研究表明，APP作为一种细胞内跨膜蛋白，在脑组织中表达最高〔20，21〕，其中极少数的APP在β-分泌酶作用下裂解成β-APPs与C99，C99在γ-分泌酶作用下裂解成Aβ40和Aβ42，其中Aβ42很容易聚集而形成AD的特征性病理之一老年斑(SP)。当然，Aβ42还可破坏神经元内离子平衡和胆碱能系统，激发脑内炎症反应，引发神经轴突、突触损伤，改变激酶/磷酸酶的活性，导致tau蛋白的过度磷酸化，形成神经纤维缠结(NFTs)〔20，22，23〕。因此，APP、Aβ尤其Aβ42的大量堆砌将会通过破坏胆碱能系统、激发氧化应激等多种机制、多种途径促成AD的发生。

本研究结果显示，菖蒲四逆散可较好地改善模型大鼠的学习记忆能力，对AD具有一定的干预效果，其可能与改善胆碱能神经递质、提升抗自由基氧化能力、促进Aβ的代谢等多种途径及相互级联影响有关，至于其深层机制有待进一步探讨。