常规培养条件下成年大鼠颈动脉体原代细胞培养

李超红 刘玉珍 (新乡医学院第一附属医院 河南省神经修复重点实验室，河南 卫辉 453100)

颈动脉体(CB)是由来源于神经脊的Ⅰ型细胞和类似神经胶质细胞的Ⅱ型支持细胞组成的位于CB分叉处的外周化学感受器，它能感受流经它的动脉血中的氧分压(PO2)、二氧化碳分压(PCO2)、pH的变化，通过窦神经将化学信号转化为电信号传入中枢，导致呼吸和心血管系统改变〔1，2〕。由于CB体积微小(大鼠3×106μm3)并含有丰富的血管网，目前针对CB的研究手段比较局限，且由于细胞培养困难且获得的细胞数目有限，故很多实验室关于CB的研究很少能达到细胞水平。其中国外常用的CB细胞培养一般多来源于幼年期(0～8周龄)动物的CB〔3，4〕，应用含有多种生长因子的特殊培养基进行培养，费用昂贵且失败率较高。前期我们对成年(8～10周龄)大鼠的CB完整组织进行常规培养，成功培养出有活性的CB组织，并可用于后续实验〔5〕。本研究在上述CB组织培养的基础上探讨通过常规培养基培养成年8～9周龄大鼠CB原代细胞的方法，观察常规培养条件下，成年大鼠CB细胞是否可以存活。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SPF级成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，8～9周龄，250～270 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(No.11400700368268)。

1.1.2主要试剂 兔抗酪氨酸羟化酶抗体(TH)和兔抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体购自abcam公司；小鼠抗巢蛋白(Nestin)抗体、兔抗β-actin抗体、抗兔Alexa Fluor®555标记荧光二抗、抗兔Alexa Fluor®488标记荧光二抗和抗小鼠Alexa Fluor®555标记荧光二抗均购自CST公司；胰蛋白酶和小鼠抗TH抗体购自Sigma公司；胶原酶Ⅳ和胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购自Invitrogen公司；脱氧核糖核酸酶购自Worthington公司；胰岛素购自碧云天公司；DMEM/F-12(1∶1)购自Thermo公司；青链霉素混合液(双抗)和磷酸盐缓冲液(PBS)购自Solarbio公司；多聚-D-赖氨酸(PDL)购自博士德公司；其余试剂为国产分析纯试剂。

1.1.3主要仪器 XYH-4A体视显微镜购自上海光学仪器一厂；3111二氧化碳培养箱购自Thermo公司；CL31R低温超速离心机购自Thermo公司。

1.1.4主要溶液配制 ①CB细胞生长培养基：DMEM/F-12(1∶1)，10% FBS，1×青链霉素混合液，胰岛素80 U/L混合备用。②胶原酶缓冲液：胶原酶Ⅳ 500 μg/ml，胰蛋白酶 500 μg/ml，脱氧核糖核酸酶50 μg/ml，1×青链霉素混合液。所有试剂均为无菌溶液。

1.2方法

1.2.1准备工作 ①PDL包被无菌玻片将5 mg/ml PDL用无菌PBS稀释成100 μg/ml，将10 mm玻片置于24孔板中，于每个玻片上滴加100 μg/ml PDL并完全覆盖玻片，37℃过夜孵育。之后无菌PBS洗涤玻片2次，超净工作台干燥1 h。②CB细胞生长培养基1 ml提前1 d置于37℃，5%CO2培养箱预温并饱和氧，分离当天提前放于冰上预冷。

1.2.2游离CB 体重250～270 g、8～9周龄健康雄性SD大鼠2只，10%水合氯醛(0.34 ml/0.1 kg)腹腔注射麻醉，断头后将头部置于冰上，游离双侧颈总动脉分叉，放于预冷并持续充罐95%O2-5%CO2混合气的PBS中，体视镜下小心去除CB周围多余结缔组织及神经节等，完全游离CB，10%双抗洗涤并放于预冷的CB细胞生长培养基中，37℃，5%CO2培养箱复温10 min。

1.2.3CB细胞消化分离 复温后，将CB移至含有100 μl胶原酶缓冲液的1.5 ml离心管，采用37℃培养箱孵育消化8 min，20 ml注射器针头斜面从CB中心对半切割CB的方法，重复3次直到肉眼看不到完整组织块，离心管中为丝状物或碎片状后，轻微吹打数次后加入100 μl CB生长培养基，1 000 r/min离心5 min后，吸取上清种于一个包被PDL的玻片上，沉淀用150 μl CB生长培养基重悬后，种于2个PDL包被的玻片上，37℃，5%CO2培养箱过夜孵育让其贴壁，次日加入200 μl CB生长培养基继续培养，并进行后续染色。

1.2.4免疫荧光化学染色 将贴有CB细胞的玻片用PBS洗涤2次后，4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗涤5 min ×3次后；0.2% TritonX-100通透7 min，PBS洗涤5 min × 3次；10%山羊血清室温封闭1 h；之后过夜孵育下述一抗或一抗混合液：兔抗TH-1∶100，兔抗TH-1∶100混合鼠抗Nestin-1∶200，鼠抗TH-1∶1 000混合兔抗GFAP-1∶100。PBS洗涤后，室温避光孵育荧光标记二抗1 h，即抗兔Alexa Fluor®555标记荧光二抗，抗兔Alexa Fluor®488标记荧光二抗和抗小鼠Alexa Fluor®555标记荧光二抗。PBS洗涤后，DAPI标记细胞核并封片。Axio Observer A1倒置荧光显微镜观察染色结果，并用AxioCam MRc5照相机拍照。

2 结 果

2.1成年大鼠CB原代培养细胞 在常规细胞培养基条件下培养成年大鼠CB原代细胞1 d后，于倒置显微镜下观察，如图1所示，玻片上可见到少许散在分布的细胞，形状不一，有些细胞成团生长，呈立体团簇状(如图1C～F)；而有些细胞成细长杆状，一端或两端膨大，散在单个生长(如图1A，B)。

2.2CBⅠ型细胞和Ⅱ型细胞鉴定 CB主要由感受氧的Ⅰ型细胞，类似神经胶质细胞的Ⅱ细胞，毛细血管，结缔组织和神经纤维所组成。为进一步确定所培养原代细胞的类型，我们采用Ⅰ型细胞标记物TH来鉴定Ⅰ型细胞。如图2所示，呈团簇状生长的细胞显示TH免疫反应阳性，说明该类细胞为典型的CBⅠ型细胞，这也与Ⅰ型细胞成簇状排列生长的特性相符合。应用Ⅱ细胞标记物GFAP来鉴定Ⅱ型细胞，如图3所示，细长纤维状且一端膨大或呈扁平状的细胞显示GFAP免疫反应阳性，说明该类细胞为与胶质细胞类似的Ⅱ型细胞。

2.3成年大鼠CB原代培养细胞Nestin染色 CB细胞继续培养4 d后，应用双荧光标记，观察成年大鼠普通培养基条件下，CB原代培养细胞中Nestin的表达情况。如图4所示，红色标记的Nestin主要位于绿色标记的TH周围。说明，成年大鼠在普通培养基条件下亦有部分具有Nestin+干细胞特性，且可分化出TH阳性Ⅰ型细胞。

2.4类胶质细胞中TH染色阳性 此外，本研究还借助β-actin观察扁平多边形类胶质细胞骨架，发现，该类型细胞中亦有TH免疫染色。推测这种细胞可能介于Ⅱ型细胞和干细胞特性之间，部分转化为Ⅰ型细胞。见图5。

A1～C1：TH(红色)和DAPI(蓝色)merge后的CBⅠ型细胞，A2，B2：A1，B1对应的Ⅰ型细胞TH染色，C2：白光下的C1图2 TH阳性Ⅰ型细胞(DAPI,Bar=20 μm)

图3 GFAP阳性Ⅱ型细胞(Bar=10 μm)

图4 大鼠CB细胞 Nestin和TH共定位染色(Bar=20 μm)

图5 大鼠CB细胞中TH和β-actin共定位染色(Bar=20 μm)

3 讨 论

本研究以成年8～9周龄大鼠CB为对象，采用酶加机械分离方法，在常规培养条件下成功培养出CB细胞，且发现成年大鼠CB细胞中含有Nestin+干细胞，这种细胞可能有利于CB的低氧应答。

CB是体内重要的外周化学感受器〔6〕，由于其体积微小，针对其的研究方案比较局限，且多针对新生或者幼龄动物。CB对氧极其敏感，导致离体后的CB极易失活，CB原代细胞培养困难，成功率较低；且由于培养基成分特殊及多种细胞因子，导致原代培养的费用比较昂贵。成年大鼠对氧更为敏感，CB本身耗氧量也较幼年增加，针对成年大鼠的CB细胞原代培养少见报道。

2017年，来自塞维利亚大学生物医学研究所的Annese等〔7〕用成年转基因小鼠及6周龄的大鼠培养CB取得成功，并发现CB细胞中含有干细胞，但这种培养需要5种特殊生长因子，费用昂贵，且大鼠为6周龄幼年大鼠。对于一些仅需要简单定性定位或者短时间处理的研究来说，该培养方法费用较高，且一旦培养过程中出现污染，造成的浪费也较大。因此寻找一种价格低廉，能够保持CBⅠ型细胞簇状生长特性且针对成年大鼠的CB原代培养方法是有必要的。而本研究正是以此为出发点，成功寻找一种针对成年大鼠的有效的、不需借助细胞因子的CB原代培养方法，该方法可以用于后期CB细胞水平研究。

CBⅠ型细胞来源于胚胎时期的神经脊，是CB的主要氧感受细胞〔8〕，其胞质内含有大量神经递质和调质〔9〕，低氧时通过释放这些神经递质和调质，兴奋与其形成突触的窦神经末梢，从而将信号传入中枢神经系统〔10〕。而CBⅡ型细胞是一种类似神经胶质细胞的支持细胞〔11〕，它支撑营养Ⅰ型细胞。在完整CB组织中，通过苏木素-伊红(HE)染色，可见到CBⅠ型细胞成簇状排列，单个CB中可见到很多团簇状的Ⅰ型细胞团，簇状细胞团之间含有丰富的毛细血管和结缔组织。进一步采用免疫组化染色发现，在簇状排列的I型细胞周围围绕着GFAP阳性Ⅱ型细胞和神经末梢，这种排列方式，有利于不同细胞间通过旁分泌或自分泌途径相互作用，更好地传递化学信号，这种特性也决定了体外培养的CB需要模拟体内环境的生长方式才能更好的从细胞水平研究其低氧应答机制。在培养CB细胞过程中，通过20 ml注射器针头斜面对半切割CB可从一定程度上减少无规律或任意撕扯造成单个细胞过多的情况，采用借助Ⅰ型和Ⅱ型细胞标志物，检测所培养的CB细胞中，簇状生长的为Ⅰ型细胞，细长杆状或扁平状的为Ⅱ型细胞，符合体内CB的细胞生长特性，可以进行后续细胞水平研究。

前期关于CB的多个研究认为〔7，12，13〕，CBⅡ型细胞在低氧条件下，可失去自身GFAP阳性染色，转变为Nestin+的干细胞，表现为干细胞特性，且随着低氧时间延长，几乎看不到Ⅱ型细胞的GFAP染色，Nestin染色反而增强或者转变为Ⅰ型细胞增多。此外，在上述关于CB干细胞的研究中，Nestin+细胞多表现为圆形球状，其周边成芽状小突起呈TH染色阳性；但也可见扁平多边形类胶质状细胞Nestin染色阳性。而在本实验中，培养4 d后，成年大鼠CB细胞中可见Nestin+的干细胞，这种细胞中可见较弱的TH染色阳性，推测这种改变可能是由于随着培养时间延长，细胞数目增多，由于细胞代谢及细胞呼吸，常规培养基处于一种低营养环境，刺激了Ⅱ型细胞干细胞分化为TH细胞。这种现象也说明这种培养方法可以用于后续短期内Ⅱ型细胞与Ⅰ型细胞间的转化研究或关于Ⅱ型细胞干细胞特性的研究。

此外，在CB细胞原代培养过程中，由于Ⅱ型细胞的干细胞特性，TH阳性反应不仅见于成团簇状生长的Ⅰ型细胞中，还可见于多边形扁平的类胶质细胞中。综上，本研究所建立的成年大鼠CB细胞原代培养方法，为深入探讨CB细胞水平机制提供了一种价格低廉，经济实用的研究方案。