贵州苗药刺梨调控SIRT1-TGFβ/Smads信号途径延缓肾纤维化的机制

郭银雪 葛平玉 马娟 詹继红

(贵州中医药大学第一附属医院 1肾内科，贵州 贵阳 550001；2泌尿外科)

肾间质纤维化是所有慢性肾脏疾病(CKD)进行性发展的最终病理结果。全国多中心横断面研究显示，我国成年人CKD的总患病率为10.8%〔1〕。而终末期肾衰竭发病率高、死亡率高，且花费大量医疗资源〔2〕。因此，探讨肾间质纤维化的防治措施在临床上有重要意义。研究显示，应用抗氧化剂能够减轻梗阻性肾损伤和肾间质纤维化〔3，4〕。刺梨是蔷薇科植物，民间主要将其果实和根入药。药理研究发现，其具有抗氧化、抗癌、提高免疫功能及抗衰老等重要药理作用〔5〕，在众多的动物实验及临床研究中均具有重要应用。刺梨冻干粉饱含刺梨黄酮及维生素C，我们前期的临床研究表明，刺梨冻干粉具有良好的抗肾纤维化效应〔6〕。本研究拟通过氧化应激指标观察刺梨冻干粉对单侧输尿管结扎术(UUO)肾纤维化模型大鼠的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1动物 50只SPF级雄性SD大鼠，体重140～160 g，由上海西普尔一必凯实验有限公司提供，合格证号：DA942C48-72F76A1E-466ABC83-FC6974。实验大鼠分笼饲养于上海中医药大学实验动物中心，设备使用证号：SCXK(沪)2013-0016，饲养于温度25℃，12 h光照、45%～55%湿度的环境中，自由饮水，普通饲料进食。大鼠纳入实验研究后均先给予为期1 w的适应性喂养。

1.2主要药物及试剂 刺梨冻干粉〔购自国药集团金刺梨(贵州)科技开发有限公司〕；氯沙坦钾片(杭州默沙东制药有限公司，批号：L037309)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购于南京建成生物工程研究所。兔抗转化生长因子(TGF)-β1多克隆抗体购于美国Santa Cruz Biotechnology公司，TGF-βⅠ型受体(TGF-βRⅠ)多克隆抗体购于武汉博士德生物公司。

1.3动物造模、分组及给药方法 将50只SD雄性大鼠，适应性喂养1 w后，按随机数据取出分为假手术组10只和手术组40只，手术组行UUO。术后第2天，手术组随机分为模型组、SIRT1激动剂组、刺梨中剂量组、氯沙坦钾组，每组10只。于分组当天，所有大鼠参照马氏定理设定干预剂量。氯沙坦组给予氯沙坦10 mg/(kg·d)，浓度为20%；刺梨中剂量组给予3 g/(kg·d)，浓度为3%；SIRT1激动剂组给予白藜芦醇25 mg/d。模型组和假手术组均同时给予同等容积无菌生理盐水灌胃。实验大鼠均每天干预1次，连续干预14 d。灌胃14 d后处死大鼠。UUO模型〔7〕的建立，以2%的戊巴比妥钠0.6～0.8 ml行腹腔注射，大鼠麻醉后取右侧卧位充分暴露左侧肾区，局部备皮、消毒，行左侧耻骨上切口，沿左肾下极寻找到左输尿管，用4-0号丝线上下结扎两处，然后从中剪断输尿管，分层缝合关闭腹腔。假手术组除不结扎和剪断输尿管外，其他均与手术组手术过程一致。

1.4相关指标的检测及实验方法

1.4.1肾组织的采集及制备 各组大鼠均于治疗后第14天处死，迅速摘取梗阻侧肾脏，予纵行切开，取一份于4%多聚甲醛中固定，做苏木素-伊红(HE)、Masson染色；一份组织放入冻存管，置于液氮中速冻后，于-80℃冰箱保存，用于肾组织MDA、SOD测定及肾组织TGF-β1及TGF-βR Ⅰ蛋白的表达。

1.4.2组织学观察 石蜡组织切片行HE、Masson染色。HE染色观察肾脏病理学改变。Masson染色半定量分析：随机选取20个互不重叠高倍视野(×400)，计算肾间质蓝色着色占全片范围。

1.4.3MDA及SOD测定 用预冷的0.85%生理盐水裂解肾组织，制成10%和1%匀浆。按试剂盒说明书操作步骤，分别测定肾组织MDA含量及总SOD活性。

1.4.4免疫组织化学方法检测 TGF-β1及TGF-βRⅠ表达水平采用Envision System 二步法。石蜡包埋的切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢(H2O2)的甲醇溶液，抗原热修复，正常兔血清封闭后，分别滴加兔抗TGF-β1多克隆抗体(1∶200)和TGF-βRⅠ多克隆抗体(1∶200)孵育过夜。滴加二抗，最后显微镜下控制二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染。同时采用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。结果评估：TGF-β1及TGF-βRⅠ的表达采用半定量分析，即随机选取20个互不重叠的高倍视野(×400)，采用IPP软件计算肾皮质阳性着色面积占一视野场面积的百分比。

1.4.5Western印迹检测 肾脏组织加细胞裂解液匀浆破碎，将裂解物移至新的离心管中，取样加入十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)混匀经相关处理后离心去除不溶性沉淀，再次取样使用SDS-PAGE分离，样品行电泳、转膜、封闭，加入一抗，4℃封闭过夜，加入二抗，室温下摇床上孵育1 h；显影。用图像分析软件Gel-Pro Analyzer测定各组蛋白的相对光密度值和目的条带及内参GAPDH条带的灰度比值，分别表示各蛋白的表达水平。

1.4.6Real-time PCR法 液氮中取50 g肾组织加入500 μl RLA 冰上匀浆，12 000 r/min 4℃离心5 min，取上清采用磁珠法RNA抽提试剂盒提取肾脏总RNA，核酸蛋白测定仪测定RNA纯度及含量，取2 μl RNA进行逆转录，反应条件65℃ 5 min，42℃ 60 min，70℃ 5 min，合成cDNA，采用20 μl反应体系进行PCR 扩增，反应条件95℃ 30 s 预变性；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。引物合成根据已发表的基因库及参考文献设计，由上海里奇生物技术有限公司合成：GAPDH正义链：5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′，反义链：5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT(113 bp)-3′；Smad 2正义链：5′-GCCGCCCGAAGGGTAGAT-3′，反义链：5′-TTCTGTTCTCCACCACCTGC(164 bp)-3′；Smad3正义链：5′-CGATGTCCCCAGCACACAATAAC-3′，反义链：5′-TAGTAGGAGATGGAGCACCAAAAGG(82 bp)-3′；Smad7正义链：5′-GGTGCGTGGTGGCATACT-3′，反义链：5′-GCTGACTCTTGTTGTCCGAAT(144 bp)-3′；TGF-βR1正义链：5′-GCAATGGGCTTAGTATTCTGG-3′，反义链：5′-AAGGCAACTGGTAGTCTTCGTG(76 bp)-3′；TGF-β1正义链：5′-CATGGAGCTGGTGAAACGGAAG-3′，反义链：5′-GACTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC(74 bp)-3′。

1.5统计学处理 采用SPSS18.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1肾脏的病理改变 肉眼观，假手术组双侧肾脏颜色红润，中等大小，外有脂肪组织包裹，包膜完整；模型组右肾正常，左侧梗阻肾肿胀，体积增大，呈囊状，皮质较薄，色暗红。光镜下，经HE和Masson染色均显示，UUO术后组织学表现为大量淋巴细胞、浆细胞浸润和间质纤维化。肾小管可见蛋白管型、红细胞管型或是萎缩；部分区域肾小管扩张，肾球囊周围纤维化，部分肾小球发生玻璃样变和纤维化。刺梨中剂量组、SIRT1激动剂组及氯沙坦钾组纤维化程度较模型组减轻(P<0.05)。见图1、2，表1。

2.2各组肾组织SOD、MDA含量比较 与假手术组相比，模型组、氯沙坦钾组、SIRT1 激动剂组及刺梨中剂量组肾组织SOD表达显著降低，MDA表达显著升高(P<0.01)；氯沙坦钾组、SIRT1 激动剂组及刺梨中剂量组差异无显著性(P>0.05)，但与模型组均有显著差异(P<0.01)。见表1。

2.3各组免疫组化TGF-β1及TGF-βRⅠ表达比较 模型组、氯沙坦钾组、SIRT1激动剂组及刺梨中剂量组肾小管上皮细胞和间质TGF-β1及TGF-βRⅠ表达水平显著高于假手术组(P<0.01)；而刺梨中剂量组、SIRT1激动剂组与氯沙坦钾组差异无显著性(P>0.05)，但均显著低于模型组(P<0.01)。见表2和图3、图4。

图1 各组肾脏组织结构改变(HE，×400)

图2 各组肾脏组织结构改变(Masson，×400)

表1 各组胶原蓝染面积与AIO面积之比及SOD、MDA水平比较

与假手术组比较:1)P<0.01；与模型组比较:2)P<0.01；下表同

表2 各组TGF-β1及TGF-βRⅠ表达比较

图3 各组TGF-β1免疫组化表达(×400)

图4 各组TGF-βRⅠ免疫组化表达(×400)

2.4各组Smad2、Smad3、Smad7表达比较 模型组、氯沙坦钾组、SIRT1 激动剂组及刺梨中剂量组Smad2、Smad3表达显著高于假手术组， Smad7显著低于假手术组(P<0.01)；氯沙坦钾组、SIRT1 激动剂组及刺梨中剂量组差异无显著性(P>0.05)，但与模型组均有显著差异(P<0.01)。见表3，表4。

表3 各组Smad2、Smad3、Smad7 mRNA水平比较

表4 各组Smad2、Smad3、Smad7蛋白表达比较

3 讨 论

肾间质纤维化是多种肾脏疾病发展至终末期肾衰竭的共同通路〔8〕。TGF-β是介导肾小球硬化和肾间质纤维化关键的细胞因子。其作用包括趋化和活化炎性细胞，介导肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化及刺激细胞外基质蛋白的合成及降低基质金属蛋白酶的活性和(或)增加蛋白酶抑制剂的合成来促进细胞外基质的沉积。系膜基质的大量积聚是引起肾小球硬化，导致肾病患者出现肾衰竭的重要病理基础，TGF-β1可促进系膜基质的合成与沉积，进而加速肾小球硬化过程。Poncelet等〔9〕发现系膜细胞可表达Smad1、Smad2、Smad3、Smad4 和Smad7。

刺梨作为药食两用植物，具有较高的药用价值。现代药理学研究证实，刺梨中含有丰富的刺梨黄酮、刺梨多糖等多种活性物质，不仅可以延缓衰老，还可增强机体抵抗力、发挥抗炎、抗癌作用，且在肾纤维化患者中应用还可增强肾小管和肾小球上皮细胞的自我修复功能〔10〕。

本实验研究显示，应用Masson观察肾脏胶原表达，模型组较治疗组胶原着色面积明显增高；说明刺梨冻干粉能减少肾脏胶原表达。应用刺梨冻干粉治疗后，UUO大鼠肾组织SOD活性提高，MDA含量降低，提示刺梨冻干粉具有抗氧化应激作用。同样免疫组化及Western印迹也显示刺梨冻干粉与氯沙坦钾具有同等抗氧化应激，抗肾纤维化的作用，而无毒副作用。

综上，刺梨冻干粉可能是通过调节SOD、MDA活性，缓解氧化应激损伤，保护肾小管上皮细胞受损，达到有效改善肾脏纤维化。其机制可能是通过激活体内SIRT1从而活化Smda7以下调TGFβⅠ、TGF-βRⅠ及Smda2、Smda3的表达。