三穗鸭ATF4基因多态性鉴定及其与蛋壳品质的关联分析
2020-05-11谭光辉李杰章覃媛钰吴磊张依裕
谭光辉 李杰章 覃媛钰 吴磊 张依裕
摘要：【目的】探讨三穗鸭转录激活子4基因（ATF4）多态性与蛋壳品质的相关性，揭示禽类ATF4的生物学功能及其遗传特性，为进一步研究蛋壳品质的调控机制打下基础。【方法】以三穗鸭为研究对象，经PCR扩增获得ATF4基因后采用直接测序法检查三穗鸭ATF4基因全部编码区的变异位点，运用SHEsis计算基因型频率、等位基因频率、单倍型频率及基因型分布卡方值（c2）等，利用PopGen32计算各SNP位点的观察杂合度（He）、有效等位基因（Ne）及多态信息量（PIC），并以SPSS 18.0中的一般线性模型（GLM）分析SNP位点对蛋壳品质的遗传效应。【结果】在三穗鸭ATF4基因第3外显子（Exon-3）上发现3个SNPs位点（g.2394G>A、g.2571A>G和g.2667A>G），均属于同义突变。3个SNPs位点在三穗鸭群体中均呈中度多态性（0.25
关键词： 三穗鸭;ATF4基因;SNP位点;多态性;蛋壳品质
0 引言
【研究意义】蛋壳作为禽蛋天然保护壳，在其保存、运输及孵化等方面发挥着重要作用;高质量蛋壳不仅能延长禽蛋的保质期，减少运输中的破损率，还能调节胚胎发育过程中的气体交换，并为胚胎的生长提供钙源，而有利于幼禽孵化（俞路等，2008;宋凌子，2019）。随着畜禽养殖规模的不断扩大，禽蛋的生产及销售已形成巨大产业链，而蛋壳破损带来的经济损失也日益突出。因此，有效提高蛋壳品质，减少蛋壳破损，已成为家禽育种研究的重要内容之一。【前人研究进展】蛋壳在蛋壳腺形成过程中需要大量的钙离子沉积（宋凌子，2019）。转录激活子4（Activating transcription factor 4，ATF4）最初被认为是一种广泛表达的哺乳动物DNA结合蛋白，又称为环腺苷酸连接效应元件2（cAMP-response element binding protein 2，cREB2），在各种应激信号诱导反应中发挥重要作用，也是内质网膜上细胞内钙离子释放的基本调控因子，对机体内钙离子的沉积具有调控作用（Rzymski et al.，2009;St-Arnaud and Mandic，2010;Singleton and Harris，2012;王慧和刘勤江，2018;Tesei et al.，2019）。ATF4基因是鸭蛋蛋壳品质调控候选基因IP3R2的下游基因，其生物功能的发挥需要钙离子活化激活，同时又是钙离子释放的基本调控因子之一（Sun et al.，2015），位于第1号染色体上，其mRNA全长1065 bp，DNA序列全长2914 bp，含3个外显子和2个内含子。Chen等（2011）研究揭示，ATF4基因多态性与猪臀部脂肪厚度（BFT）、腰眼高度（LEH）、腰眼面积（LEA）及骨骼发育显著相关。Voloshanenko等（2018）研究发现，结肠癌细胞的生长和增殖依赖于b-连环蛋白及独立的Wnt信号传导途径，在Wnt信息传导路径中ATF4和ATF2能调控多种目标基因表达。此外，ATF4和ATF2基因沉默会降低靶基因原胶原赖氨酸-2-酮戊二-5-双加氧酶（Recombinant procollagen lysine-2-oxoglutarate-5-dioxygenase，PLOD2）和配体依赖的辅阻遏物（Ligand-dependent corepressor，LCOR）表达，推测ATF4基因涉及Wnt信号传导，而对癌细胞的生长和增殖有一定影响（De，2011;Ackers and Malgor，2018）。此外，ATF4基因在动物的眼部和骨骼发育等方面发挥重要作用。Ameri和Harris（2008）研究表明，若缺失ATF4基因，小鼠则表现出盲眼、贫血及钙离子分泌不足造成骨骼发育不良等症状。Rzymski等（2009）、Saito等（2011）研究发现，在成骨细胞的分化进程中，PERK-Eif2a-ATF4信号路径能诱导成骨必需基因的表达，如骨钙素基因。综上所述，ATF4能调节机体细胞内钙离子的释放，影响细胞的凋亡与增殖，而直接或间接影响生物体表型性状。【本研究切入点】近年来，有关ATF4生物学功能的研究主要集中在人类和小鼠上（秦蜀等，2018;张晟等，2019;Xin et al.，2019），而鲜见针对禽类ATF4的研究报道。【拟解决的关键问题】以三穗鸭为研究对象，探讨ATF4基因多态性与其蛋壳品质的相关性，揭示禽类ATF4的生物学功能及其遗传特性，为进一步研究蛋壳品质的调控机制打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
用于检测ATF4基因多态性的288羽三穗鸭样本来自贵州大学动物科学学院农场，45周龄，健康无病，且均采取单体笼饲养的管理方式。采用无抗凝剂的普通生化管对每羽三穗鸭翅静脉采血1.0～1.5 mL，采血管编号与其翅号一致，静置斜放待血清析出后用移液枪将血清转移至离心管中，离心至样品清澈透亮，-20 ℃保存备用。逐一收集记录产蛋情况并编号（与翅号一致），进行蛋壳品质测定。全血DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，2×Taq PCR MasterMix试剂和琼脂糖购自北京康为世纪生物科技有限公司，DM2000 DNA Marker购自重庆擎科生物科技有限公司。主要仪器设备：DYY-2C电泳仪（北京六一生物科技有限公司），PTC200梯度PCR仪（美国Bio-Rad公司），BL-320H电子天平（日本岛津公司），EFR-01蛋壳强度测定仪（北京天翔飞域仪器设备有限公司），EA-01蛋品质分析仪（北京天翔飞域仪器设备有限公司），HRLM-80高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂）。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 基因组DNA提取 按照动物全血DNA提取试剂盒说明抽提血清基因组DNA，DNA编号对应三穗鸭翅号，以1.0%琼脂糖凝胶电泳结合核酸浓度测定仪进行检测，稀释至终浓度100 ng/mL，备用。
1. 2. 2 引物设计与合成 根据GenBank已公布的鸭ATF4基因序列（登录号NC_040046.1），以Primer 3.0（http：//primer3.ut.ee/）设计扩增ATF4基因所有编码区的5对引物（表1），所有引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1. 2. 3 DNA池PCR扩增及测序分型 PCR反应体系20.0 mL：PCR MasterMix 8.0 mL，正、反向引物各1.0 mL，DNA模板1.0 mL，RNase-Free Water 9.0 mL。扩增程序：95 ℃预变性6 min;94 ℃ 30 s，退火50 s，72 ℃ 45 s，进行35个循环;72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，并以MegAlign筛选单核苷酸多态性（SNP）位点。根据SNP位点，以个体DNA为模板，选用相应引物进行PCR扩增，扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，并进行基因分型。
1. 3 数据处理
运用SHEsis（http：//analysis.bio-x.cn/）计算基因型频率、等位基因频率、单倍型频率、基因型分布卡方值（c2）和连锁不平衡的D和g2，采用PopGen32计算各SNP位点的观察杂合度（He）、有效等位基因（Ne）及多态信息量（PIC），并利用SPSS 18.0中的一般线性模型（GLM）分析SNP位点基因型和双倍型与蛋壳品质性状指标的相关性。
2 结果与分析
2. 1 三穗鸭ATF4基因多态性分析结果
使用MegAlign对三穗鸭ATF4基因多态性进行分析，结果在鸭ATF4基因第3外显子（Exon-3）上共发现3个SNPs位点，且每个SNP位点均存在3种基因型，如图2所示。3个SNPs位点分别是：g.2394G>A、g.2571A>G和g.2667A>G。进一步分析发现，3个SNPs位点均属于同义突变，未引起编码氨基酸变化。
2. 2 三穗鸭ATF4基因群体遗传学分析结果
对三穗鸭ATF4基因检测到的3个SNPs位点进行遗传特性分析，结果（表2）表明，g.2571A>G位点以GA基因型为优势基因型，其基因型频率为0.479，以G为优势等位基因，其频率为0.573;该SNP位点在三穗鸭群体中的He为0.489。g.2667A>G位点以AA基因型为优势基因型，其基因型频率为0.469，以A为优势等位基因，其频率为0.672;该SNP位点在三穗鸭群体中的He为0.441。g.2394G>A位点以GG基因型为优势基因型，其基因型频率为0.458，以G为优势等位基因，其频率为0.682;该SNP位点在三穗鸭群体中的He为0.434。3个SNPs位点在三穗鸭群体中均呈中度多态性（0.25 2. 3 三穗鸭ATF4基因SNP位點的连锁不平衡分析结果 D和g2是常用于衡量连锁不平衡的2个重要参数，其中，区域内重组事件发生连锁不平衡的概率通过D反映，而连锁分析通过g2反映（Mayo，2008）。当D>0.8时，表明SNP位点间强连锁且不平衡，当g2>0.330时，表明SNP位点间紧密连锁且趋向于一个整体遗传（Ardlie et al.，2002;Slatkin，2008）。由表3可知，g.2667A>G位点与g.2571A>G位点间的D为1.0，大于0.8，且g2为0.665，大于0.330，可确定这2个位点间处于强连锁不平衡状态，即g.2667A>G位点和g.2571A>G位点为高度连锁，趋向整体遗传;g.2394G>A位点与g.2571A>G位点间的D为1.0，大于0.8，且g2为0.347，大于0.330，可确定这2个位点间存在强连锁不平衡状态;g.2667A>G位点与g.2394G>A位点间的D为1.0，大于0.8，但g2为0.227，小于0.330，说明这2个位点间不存在强连锁不平衡。 2. 4 三穗鸭ATF4基因SNP位点的单倍型和双倍型分析结果 三穗鸭ATF4基因SNP位点的单倍型和双倍型分析结果如表4所示，3个SNPs位点在三穗鸭群体中共检测到4种单倍型（H1、H2、H3和H4）和9种双倍型（H1H2、H1H3、H1H4、H2H2、H2H3、H2H4、H3H3、H3H4和H4H4）。其中，H2（AGG）为优势单倍型，其频率为0.328，H1（AAG）为劣势单倍型，其频率为0.099;H2H3（GAGAGA）为优势双倍型，其频率为0.219，H1H2（AAGAGG）和H1H3（GAAAGG）为劣势双倍型，其频率均为0.063。 2. 5 三穗鸭ATF4基因SNP位点基因型与蛋壳品质的关联分析结果 三穗鸭ATF4基因3个SNPs位点基因型与蛋壳品质的关联分析结果（表5）表明，g.2571A>G位点不同基因型个体间的蛋重和蛋壳重存在一定差异，以GA基因型个体的蛋重和蛋壳重最高，其次是GG基因型个体，AA基因型个体的最低，GA基因型个体的蛋重和蛋壳重均显著高于AA基因型个体（P<0.05，下同）;g.2667A>G位点不同基因型个体间的蛋壳厚度存在一定差异，GG基因型个体的蛋壳最厚，AA基因型个体的蛋壳最薄，二者差异显著;g.2394G>A位点不同基因型个体间的蛋壳品质未存在显著差异（P>0.05，下同）。 2. 6 三穗鸭ATF4基因SNP位点双倍型与蛋壳品质的关联分析结果 三穗鸭ATF4基因双倍型与蛋壳品质的关联分析结果（表6）表明，H2H2个体的蛋壳厚度显著高于H1H4个体和H4H4个体，H2H2个体和H3H4个体的蛋壳强度显著高于H3H3个体，H2H2个体的蛋形指数显著高于H4H4个体，H4H4个体的蛋重显著高于H1H2个体和H2H2个体，H4H4个体的蛋壳重显著高于H3H3个体，其他双倍型与蛋壳指标间未产生显著影响。 3 讨论 近年来，有关ATF4基因多态性的研究主要集中在人类和动物上（Qu et al.，2010;Morris et al.，2014）。本研究在贵州地方品种三穗鸭ATF4基因的Exon-3上检测到3个SNPs位点：g.2394G>A、g.2571A>G和g.2667A>G，均属于同义突变，且这3个SNPs位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡。Hardy-Weinberg平衡常用于预测未来世代的基因型和等位基因频率，评估当前种群的平衡状态，在一个大孟德尔群体中的个体间进行随机交配，同时不存在选择、突变、迁移和遗传漂变发生时，其基因频率将保持不变，即这个群体被称为处于Hardy-Weinberg平衡（Mayo，2008）。由此推测，本研究中的3个SNPs位点尚未受到突变、选择及遗传漂变等的影响。畜禽基因组功能结构基因的变异可能会影响其生产性状，而变异位点间的连锁关系则决定群体遗传结构的变化。本研究通过3个SNPs位点的连锁不平衡分析，结果发现g.2667A>G位点和g.2394G>A位点间不存在强连锁不平衡，说明这2个SNPs位点间趋向独立遗传，而其他SNP位点间均处于强连锁不平衡状态;此外，3个SNPs位点在三穗鸭群体中共检测到4种单倍型（H1、H2、H3和H4）和9种双倍型（H1H2、H1H3、H1H4、H2H2、H2H3、H2H4、H3H3、H3H4和H4H4），但理论上应该有8种单倍型和36种双倍型，实际观测值与理论值存在差异，可能是长期人工选育致使其他单倍型个体消失，也可能与本研究选择的三穗鸭群体数量较少有关。由于3个SNPs位点均处于中度多态性，更有利于遗传选择（陈祥等，2017;李青等，2019），可在今后的遗传选育工作中获得更高的遗传潜力;且3个SNPs位点的He相近，表明三穗鸭群体具有较高的遗传质量（张跃博等，2018），但更精确的遗传多样性评价可能需要更多的样本数量来支持。 本研究的关联分析结果显示，g.2571A>G位点对蛋壳品质产生明显影响，GA基因型个体和GG基因型个体的蛋重分别比AA基因型个体重2.569和2.105 g，其差异均达显著水平，且GA基因型个体的蛋壳重显著高于AA基因型个体;g.2667A>G位点对蛋壳厚度产生明显影响，GG基因型个体的蛋壳厚度显著高于AA基因型个体;g.2394G>A位点不同基因型与蛋壳品质性状间的相关性尚未达显著水平。综合各蛋壳品质性状指标与不同基因型间的相关性，可初步确定GG基因型是对蛋壳品质有利的基因型。单个核苷酸碱基突变可引起蛋白构象变化，增加或降低熵值，影响基因复制速度、转录剪接过程及蛋白翻译速度，甚至影响其半衰期，即通过调控基因表达水平进而影响畜禽生产性能（Gahlon et al.，2018）。g.2571A>G位点和g.2667A>G位點与蛋壳品质存在显著相关性，推测其原因是A→G突变影响ATF4基因剪接的外显子基序（Moura et al.，2011;Sauan and Kimchi-Sarfaty，2011;Supek et al.，2014），而基因剪接是基因表达中最重要的过程，直接影响ATF4基因编码蛋白翻译及蛋白功能、构象和表达水平的变化，进而影响机体钙离子表达及引起机体调控蛋壳形成相关组织细胞的增殖和凋亡，间接或直接对蛋壳品质产生影响。 动物表型除受单个核苷酸碱基突变影响外，多个SNPs位点的组合效应也对其表型产生明显影响。将多个SNPs位点进行组合产生的基因型分析能同步考虑非等位基因的相互作用及突变位点间的连锁不平衡，具有更好的统计效力（Orozco et al.，2009）。本研究的SNP位点双倍型与蛋壳品质关联分析结果表明，3个SNPs位点联合组成的双倍型对蛋壳品质性状指标有不同程度的影响，H2H2个体的蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数均最高，综合各项蛋壳品质性状指标在不同双倍型个体间的差异，认为H2H2（AAGGGG）双倍型是对三穗鸭蛋壳品质最有利的基因型，且3个SNPs位点共同对蛋壳品质的影响效应明显大于单个SNP位点，说明3个SNPs位点共同联合引起基因结构变化强于单个SNP位点，其对蛋壳品质的调控作用可能更有效。但由于部分双倍型个体数量相对较少，其统计分析结果尚需进一步增加测试样本以确定研究结论。 4 结论 三穗鸭ATF4基因存在3个SNPs位点（g.2394G>A、g.2571A>G和g.2667A>G），均属于同义突变，其中g.2571A>G和g.2667A>G位点对蛋壳品质有显著影响，3个SNPs位点组合基因型对蛋壳品质也产生显著影响，可作为鸭蛋蛋壳品质选择的分子遗传标记。 参考文献： 陈祥，龙威海，孙振梅，冯文武，李鹏程，许厚强. 2017. 贵州地方山羊FSHR基因与繁殖性状的相关性研究[J]. 农业生物技术学报，25（1）：94-101. 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