番鸭A—FABP基因内含子多态性与生产性能的关联分析

秦豪荣++董飚++孙国波等

摘要：采用PCR-SSCP技术对黑羽番鸭A-FABP基因内含子进行多态性检测，分析多态性与早期体质量、屠宰性能、常规肉品质、肌肉营养成分等指标的相关性。结果表明：黑羽番鸭A-FABP基因第1内含子存在G921C单核苷酸突变，形成了HH、HI、II 3种基因型，H等位基因频率为0.129 6，I等位基因频率为0.870 4，群体纯合度为0.774 3，多态信息含量为0.200 2；除2周龄公鸭II型体质量显著高于HI型外，同性别黑羽番鸭早期体质量在不同基因型之间并无显著差异；公鸭、母鸭均表现为II基因型腹脂质量、腹脂率显著高于HI基因型，公鸭HI型肝质量、腺肌胃质量显著高于II型，其他屠宰性能指标在同性别黑羽番鸭不同基因型之间无显著差异；同性别黑羽番鸭II型胸肌中肌苷酸含量显著高于HI型，胆固醇含量在不同基因型间无显著差异；腿肌中同性别不同基因型间胆固醇、肌苷酸含量差异不显著。综合分析可知，A-FABP基因内含子1中921位的G-C突变会影响黑羽番鸭脂肪沉积能力、胸肌肌苷酸含量。

关键词：黑羽番鸭；A-FABP基因；多态性；生产性能

中图分类号： S834.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0030-04

收稿日期：2015-03-31

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（14）2072]；江苏省农业三新工程（编号：SXGC[2014]272）。

作者简介：秦豪荣（1966—），男，山西稷山人，硕士，教授，主要从事水禽品种保护、开发和利用工作。E-mail：391248766@qq.com。目前，我国大部分地区所饲养的肉用型鸭主要是樱桃谷鸭、北京鸭、番鸭等，均表现为生长速度快、饲料报酬高等特点，可以满足多层次消费者的需求。其中番鸭原产于美洲中南部的热带地区，是栖鸭属鸭种，与其他类型肉鸭不同属。番鸭根据羽毛颜色分为白色、黑色、花色3种，其中白羽番鸭体型较大，花羽番鸭体型居中，黑羽番鸭体型较小。番鸭产肉独特，具野禽风味特点，胴体脂肪含量低，但在番鸭产品加工和烹饪中，适当的脂肪沉积有利于增加鸭肉的风味和品质。禽类脂肪沉积是由遗传、营养、饲养环境等因素决定的，其中遗传是最基本的因素[1]。在遗传因素中，与脂肪沉积相关的功能基因较多，如过氧化物酶体增殖剂激活受体、脂联素基因、脂肪酸结合蛋白等，它们在脂肪沉积过程中起着重要作用，但是每个功能基因的作用又是微效的。

脂肪酸结合蛋白（fatty acid binding protein，FABP）是一类细胞内蛋白质，可以与脂肪酸结合将其运输到脂肪酸氧化、甘油三酯及磷脂的合成位置，调节细胞内脂肪合成[2]。FABPs类型较多，其命名是根据分离出的第1种组织来确定的，目前至少有11种，脂肪型脂肪酸结合蛋白（A-FABP）基因就是首先在脂肪组织中被发现、在脂肪组织中高度表达的。樱桃谷鸭内含子2中的4个单核苷酸突变会显著影响腹脂质量、腹脂率、皮脂率和腿肌脂肪含量等指标，推测A-FABP基因与鸭脂肪代谢有着密切的关系[3]。A-FABP基因内含子1中T1074G、A1089C突变形成的基因型之间胸肌率、肌肉pH值以及胸肌肌内脂肪含量有显著性差异[4]。A-FABP含量与鸡肌内脂肪（IMP）含量有着密切的关系，A-FABP基因被作为肌苷酸（IMF）含量的候选基因，可影响肌肉的肉质[5-6]。禽类A-FABP基因与脂肪沉积、肌肉品质等方面的研究已经起步，但是其影响程度如何还需继续开展此方面的工作。本研究运用单链构象多态性（SSCP）原理检测黑羽番鸭A-FABP基因多态性，测定早期体质量、13周龄屠宰性能、常规肉品质和肌肉中营养成分等指标，分析A-FABP基因多态性与生产性能的关联性，以期为鸭A-FABP基因功能研究提供资料。

1材料与方法

1.1试验动物

选择健康、同日龄出雏的黑羽番鸭公鸭96羽、母鸭66羽，分别佩戴翅号，混群饲养。0～3周龄封闭式舍饲育雏，所用饲料代谢能12.0 MJ/kg，粗蛋白质含量20.0%。4～13周龄半封闭式饲养，其中4～7周龄饲料代谢能11.5 MJ/kg，粗蛋白质含量16.5%；8～13周龄饲料代谢能11.0 MJ/kg，粗蛋白质含量16.0%。

1.2数据采集

1.2.1产肉性能测定测定黑羽番鸭初生、2、4、6、8、10、13周龄时体质量，测定13周龄时宰前活质量、屠体质量、半净膛质量、全净膛质量、腿肌质量、胸肌质量、肝质量、心质量、腺肌胃质量、腹脂质量等屠宰指标，各指标测定方法及其比例计算公式参考NY/T 823—2004《家禽生产性能名词术语和度量统计方法》。

1.2.2肉质性能测定在13周龄时，测定胸肌和腿肌的失水率、剪切力（嫩度）及pH值等常规肉质性状，测定方法参考NY/T823-2004《家禽生产性能名词术语和度量统计方法》。肌肉中胆固醇的含量采用气相色谱仪测定。肌苷酸含量采用索氏浸提法提取，用仪器进行HPLC分析。

1.3引物设计

根据A-FABP基因序列在第1、2内含子上分别设计了1对引物，用于多态性检测（表1）。表1引物基本信息

1.4试验步骤

1.4.1鸭基因组DNA的制备在13周龄时，每羽鸭翅静脉采血1mL，肝素钠抗凝，离心留取红细胞。血液红细胞在55 ℃下经过裂解液、SDS、蛋白酶K的混合液过夜消化，用常规酚/三氯甲烷法抽提和乙醇沉淀法获取基因组DNA，待乙醇挥发后加水溶解，测定DNA质量后将其浓度调整为50～100 ng/μL备用。

1.4.2PCR扩增反应PCR反应体系：反应总体积为20 μL，各组分浓度为：1×buffer（含1.5 mmol/L Mg2+ ）、0.8 mmol/L dNTPs、上下游引物各0.4 pmol/L、0.04 U/μL Taq酶、4 ng/μL DNA模板，用蒸馏水调整确保各成分浓度。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，温度降低至室温。

扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，成像条带清晰，与预期片段大小一致，可用于SSCP检测。

1.4.3SSCP分析及测序5 μL PCR 产物和4 μL加样缓冲液混匀（主要成分为去离子甲酰胺），98 ℃变性10 min，然后冰水浴5 min，变性后PCR产物用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳过夜，电压根据条带位置进行调整，银染显色，进行基因型判别。

对每种纯合子基因型的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶纯化回收，通过克隆、测序等流程获得不同基因型的DNA序列，通过比对获知基因型之间核苷酸序列发生位置。

1.5数据处理

运用公式计算基因型频率、等位基因频率、纯合度、杂合度和多态信息含量等遗传参数，运用SPSS13.0软件中的单因素方差分析法比较不同基因型间生产性能的差异程度。

2结果与分析

2.1基因型识别和序列比较

所设计的2对引物均可扩增出产物，通过琼脂糖凝胶电泳检测发现条带单一，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳发现，引物P1存在多态性。黑羽番鸭部分样品引物P1检测结果见图1，可以看出形成了3种基因型，分别命名为HH、HI、II。通过测序获得HH、II纯合子的序列，比对发现2个序列之间只有1个位点发生了碱基突变，为第1内含子第921处的G-C突变（图2）。

2.2群体遗传信息统计

在所测群体中HH型频率为0.018 5，HI型频率为0.222 2，II型频率为0.759 3，H等位基因频率为0.129 6，I等位基因频率为0.870 4，群体纯合度为0.774 3，杂合度为0.225 7，多态信息含量为0.200 2。

2.3不同基因型间体质量比较结果

由于公鸭、母鸭HH基因型数量小于3个，故没有参与基因型和生产性能相关性分析。由表2可知，除2周龄公鸭II型体质量显著高于HI型外，其他测定点公鸭不同基因型间无显著性差异；各个测定点母鸭不同基因型间体质量均无显著差异。

2.4不同基因型间屠宰性能比较结果

由表3可知，HI型公鸭肝质量、腺肌胃质量显著高于II型公鸭，II型公鸭腹脂质量、腹脂率显著性高于HI型公鸭，其他指标在公鸭不同基因型之间无显著性差异。II型母鸭腹脂质量、腹脂率显著性高于HI型母鸭，其他指标在母鸭不同基因型之间无显著性差异。

2.5不同基因型间常规肉品质比较结果

由表4可知，HI型公鸭腿肌pH值显著高于II型公鸭，其他指标在公鸭（或母鸭）不同基因型之间无显著性差异。

2.6不同基因型间肌肉营养成分比较结果

由表5可知，II型黑羽番鸭胸肌中肌苷酸含量显著高于同性别HI型，胆固醇在公鸭胸肌中无显著差异；腿肌中同性别不同基因型间胆固醇、肌苷酸含量差异不显著。

3结论与讨论

在真核生物基因组序列中，只有少数序列在基因转录过程中通过一系列过程得以拼接形成能够翻译蛋白质的编码区表5不同基因型间肌肉营养成分含量比较

性别基因型样本量

（羽）胸肌腿肌胆固醇含量（mg/g）肌苷酸含量（mg/g）胆固醇含量（mg/g ）肌苷酸含量（mg/g）公鸭HI950.18±9.70b2.71±0.32b48.75±6.23a2.56±0.45bII3357.53±9.72ab3.44±0.57a53.98±8.55a2.88±0.78ab母鸭HI1251.82±10.81ab2.46±0.55b49.27±6.97a3.03±0.54abII3058.48±10.86a3.26±0.42a55.09±9.51a3.36±0.54a

序列，而绝大部分序列作为非编码区序列被切除。研究者发现，基因组中非编码序列的比例与生物的复杂度成正比[7]。内含子就是非编码区序列之一，虽然不能直接编码蛋白质，但是在转录和翻译过程中对基因的表达具有调控作用，还可增强生物对基因突变耐受力，提高物种生存能力[8]。内含子潜在的作用备受广大研究者的青睐，相关研究已经开展。本试验在A-FABP基因内含子1、2上各设计了1对引物，采用PCR-SSCP方法检测了黑羽番鸭A-FABP基因存在的单核苷酸多态，结果在第1内含子第921处发现了G-C突变，形成了HH、HI、II 3种基因型，其中HH基因型含量较低，II基因型含量较高，I等位基因频率是H型的7倍，占据明显优势，其原因可能是在黑羽番鸭培育过程中由于生产性能方面指标的选育使I等位基因频率被间接地提高了。遗传参数分析显示，群体纯合度为0.774 3，杂合度为0.225 7，多态信息含量为0.200 2，群体杂合度和多态信息含量数据反映了黑羽番鸭该位点呈现低度多态，此位点的变异程度小，可进行选择的空间窄。通过常规的育种方法间接提高II型的比例难度很大，但是用分子标记技术可以检测每羽鸭的基因型，根据需要选择公、母鸭进行配种得到理想的基因型个体。

动物A-FABP可以作为体内甘油三酯的贮存库，通过储存或释放出大量的脂肪酸来调控甘油三酯的形成和脂解，从而参与脂生产及脂解的生化循环[9-10] 。罗桂芬等报道A-FABP基因突变对鸡脂肪沉积有显著影响[11]。Wang等研究发现 A-FABP 多态性与体质量、腹脂率的关系，表明 A-FABP基因的变异与腹脂率显著相关[12]。本试验结果显示，黑羽番鸭早期体质量在不同基因型之间并无显著差异；在屠宰性能方面，公鸭和母鸭均表现为II基因型腹脂质量、腹脂率显著高于HI基因型，公鸭HI型肝质量、腺肌胃质量显著高于II型，其他屠宰性能指标在同性别不同基因型之间无显著差异，揭示了A-FABP基因该位点多态性与黑羽番鸭脂肪沉积能力有着密切的关系。

肌肉品质分析包括了常规肉品质和肌肉中营养成分分析。本试验常规肉品质测定了胸肌、腿肌的pH值、剪切力、失水率 3个指标，发现只有公鸭腿肌pH值在不同基因型之间存在显著差异，其他指标在同性别不同基因型之间均无显著差异。肌苷酸是肉质鲜味的重要成分，是衡量肉质鲜味的一项重要指标[13]。在动物被屠宰后，肌肉中ATP酶活化分解ATP成为ADP，ADP在多种酶的作用下生产肌苷酸，并进一步水解产生次黄嘌呤和核糖。肌肉中次黄嘌呤核苷酸及其他分解产物的积累可增加肉的鲜味[14]。胆固醇是人体维持正常生理活动的必需物质，但是过量摄入胆固醇会使血液中胆固醇含量升高，引起心脑血管疾病。本试验发现，II型黑羽番鸭胸肌中肌苷酸含量显著高于同性别HI型，公鸭胸肌中胆固醇含量在不同基因型之间无显著差异；腿肌中同性别不同基因型间胆固醇、肌苷酸含量差异不显著，说明A-FABP基因内含子1存在多态性对胸肌中胆固醇、肌苷酸含量有显著影响。

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