关岭黄牛ANGPTL4基因多态性与生长性状关联分析

徐龙鑫+刘镜+张麟+何光中

摘要：为研究牛血管生成素样蛋白4（angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4）在调节脂肪和能量代谢中的作用，采用DNA测序技术，对关岭黄牛92头个体ANGPTL4基因的多态性进行研究，分析多态性位点与关岭黄牛生长性状的相关性。结果表明，在扩增片段为752 bp的产物中，发现387 C>T、418 C>T、449 A>T等3个突变位点，3个突变位点均处于哈代-温伯格不平衡状态（HWE）（P<0.05），3个多态位点的多肽信息含量（PIC）均为中度多态。相关性检测结果表明，418 C>T突变位点不同基因型关岭黄牛的体高、体斜长、胸围、腹围表现出差异极显著（P<0.01），449A>T突变位点不同基因型关岭黄牛的体高表现出差异显著（P<0.05），胸围、腹围表现出差异极显著（P<0.01）。

关键词：关岭黄牛；ANGPTL4基因；多态性；关联分析

中图分类号： S823.8+12 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）09-0051-02

血管生成素相关蛋白4（angiopoietin-related protein 4，ANGPTL4）是与血管生成、脂类代谢、葡萄糖代谢、胰岛素敏感性密切相关的分泌性蛋白质因子[1-3]，并与TGFβ信号通道直接关联，在肿瘤细胞的恶性转移过程中起着关键作用[4]。现有研究表明，类血管生成素4除了在血管发生方面同血管生成素（ANGPTL）相似的作用外，它还可以抑制脂蛋白脂肪酶的活性同时正调控血浆甘油三脂水平[5-6]，促进脂肪动员，抑制脂肪贮存[7]。它是调控脂类分化和葡萄糖代谢动平衡的核受体，因此，ANGPTL4基因可能在脂类代谢和葡萄糖代谢动平衡的调控方面发挥作用[8-9]。

目前，在人和鼠上对ANGPTL4基因的研究报道较多，但是家畜该基因的研究报道较少。马云克隆了牛的ANGPTL4基因的CDS序列和部分DNA序列，运用测序和PCR-SSCP相结合的方法对该基因的部分基因组DNA片段进行单核苷酸多态性检测[10]，同时运用一般线性模式研究ANGPTL4基因与8个品种牛肉质性状的相关性，结果表明，牛ANGPTL4基因的遗传变异与牛育肥后肌内脂肪含量存在密切关系。研究ANGPTL4基因的结构和功能，剖析其影响牛肌间脂肪含量的分子机制，有助于实现肌间脂肪含量性状的遗传改良。

本研究采用直接测序方法，以贵州关岭黄牛为对象，研究ANGPTL4基因的多态性，同时与关岭黄牛生长性状进行关联分析，旨在寻找牛ANGPTL4基因与代谢调控的关系，寻找黄牛与生长性状有关的分子标记，为贵州黄牛标记辅助育种提供基础资料，为提高贵州黄牛的生长性能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

92头关岭黄牛全血样采自贵州省关岭县种群核心保种区。采取的黄牛全血样肝素抗凝，放入冰盒中带回实验室-80 ℃ 保存备用。在采样的同时，对各个体的生长性状、体长数据进行测定。

1.2 基因组DNA的提取

采用蛋白酶K和TaKaRa Blood Genome DNA Ex-traction Kit（购于北京天根生物公司）提取基因组DNA。

1.3 引物设计和PCR扩增

根据在GenBank 中登录的牛ANGPTL4基因序列（GenBank登录号为NC 007305.4），使用引物设计软件PrimerPremier 5.0设计1对引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列信息见表1。

PCR反应体系为20 μL，其中2×Taq PCR Master Mix10 μL，购于北京天根生物公司；上下游引物各1 μL；DNA 模板2 μL；ddH2O 6 μL。PCR 反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存备用。

1.4 PCR产物的测序

将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳，然后用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收扩增片段，送生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.5 数据统计与分析

用DNAstart软件包中的SeqMan对测序所得的序列进行校对，用Clustalx程序进行同源性比对。基因型频率、等位基因频率、杂合度等群体遗传参数采用Popgene生物技术软件处理。运用SPSS 13.0分析生长性能数据及关联性。

2 结果与分析

2.1 ANGPTL4基因SNP检测

由图1可见，关岭黄牛ANGPTL4基因PCR扩增片段长度为752 bp，经测序检测发现，387 C>T、418 C>T、449 A>T等3个突变位点均存在2种基因型。

2.2 关岭黄牛ANGPTL4基因多态性分析

由表2可见，3个变异位点均是杂合子基因型为优势基因型。387 C>T变异位点C等位基因频率小于T等位基因，418 C>T变异位点C等位基因频率大于T等位基因，449A>T变异位点A等位基因频率大于T等位基因。HWE检测结果表明，3个变异位点均处于HWE不平衡状态（P<0.05）。3个变异位点的杂合度 （He） 介于0.441 9～0.492 7之间，有效等位基因（Ne）介于1.784 1～1.960 8之间，多态信息含量（PIC）均呈现中度多态。

2.3 关岭黄牛ANGPTL4基因多态位点与生长性状关联性分析

如表3所示，将关岭黄牛ANGPTL4基因多态位点与关岭黄牛体高、体斜长、胸围、腹围、管围、十字部高、坐骨端宽 7个生长性状指标进行关联性分析，418 C>T变异位点CT基因型个体体高、体斜长、胸围、腹围极显著大于CC基因型；449 A>T变异位点AA基因型个体体高显著大于AT基因型，胸围、腹围极显著大于AT基因型。

3 结论与讨论

候选基因法是一种寻找畜禽重要经济性状遗传标记的常用方法，它可以直接研究该基因多态性与个体经济性状的关系。本研究通过测序方法对关岭黄牛的ANGPTL4基因进行多态性分析，并与生长性状进行关联性分析。结果发现，3个变异位点均具有2种基因型。从进化角度看，群体中的遗传多样性是历史的产物[11]，多态性信息含量和杂合度都是群体内遗传变异的重要度量指标，杂合度值越大，群体内的遗传变异就越大。多态信息含量值衡量基因变异程度高低，Botstein等提出衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标，当PIC>0.5 时，该变异位点为高度多态；当0.25

ANGPTL4蛋白是一种具有广泛生理功能的物质，尤其对脂代谢的调控具有重要作用，脂代谢影响肉质的嫩度、风味和多汁性，脂肪性状是衡量肉质的重要指标之一。因此，研究ANGPTL4基因的突变对对牛生长发育的影响具有重要的理论和实践意义。本研究中发现，418 C>T变异位点CT基因型个体体高、体斜长、胸围、腹围极显著大于CC基因型；449 A>T变异位点AA基因型个体体高显著大于AT基因型，胸围、腹围极显著大于AT基因型。因此，ANGPTL4基因完全可以作为牛生长性状的潜在遗传标记，为贵州黄牛肉用性能分子育种提供理论依据。

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