和田羊KRT35基因遗传多样性及其与羊毛长度的关联性分析

晏华春+马晓燕+依明?苏来曼+刘红娇+韩煜茹+刘婷婷

摘要：以随机采集的400只和田羊个体的血样为材料，利用PCR-SSCP、DNA测序等技术研究分析和田羊KRT35基因的多态性，并与羊毛长度进行关联分析。和田羊KRT35基因具有多态性，存在3种基因型，即AA、AB和BB，且处于Hardy-Weinberg非平衡状态，多态信息含量（PIC）为0.366 3，属于中度多态（0.5>PIC>0.25）。测序结果显示，与原基因碱基序列相比，KRT35基因编码区片段在RT35基因组c.122位置发生错义突变T→C。关联分析结果表明，和田羊不同基因型之间羊毛长度差异均不显著。

关键词：和田羊；KRT35基因；多态性；羊毛长度；关联分析

中图分类号： S826.2

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）04-0028-03

和田羊作为和田地毯产业链中的重要环节，其羊毛品质的提高将直接促进地毯质量的全面提升，将有力支撑地方经济的可持续发展。毛纤维具有高度的组织结构，其中毛纤维的90%是由角蛋白中间丝（keratin intermediate filament，KRT-IF）和角蛋白关联蛋白（keratin-associated proteins，KAPs）构成[1-2]。研究发现，在美利奴羊中，KAP1.1、KAP1.3、K33等KAPs影响羊毛性状和品质[3]，KAP1-4也影响羊毛性状[4]，KRT27、KRT85、KRT35、KRT31、KRT38、KAP6.1和KAP4.3等影响毛囊分裂和毛囊结构[5]。遗传因素涉及绵羊品种及其他重要功能基因，是影响绵羊经济性状的基本因素[6-7]。所以很多学者普遍通过基因方面的研究，认为多基因对毛绒性状影响较大，可能存在主效基因，因此当前的研究热点主要是毛绒纤维的角蛋白中间丝和角蛋白关联蛋白相关基因的研究。KRT35基因是角蛋白中间丝蛋白家族之一，本试验选择优良的异质半粗毛短脂尾和田羊作研究对象，采用PCR、DNA测序等技术对和田羊KRT35基因进行多态性检测，并和其对应的羊毛长度进行关联性分析，主要为找到改善其羊毛长度分子标记位点，为新疆和田羊经济性状的选育、品种资源的保存提供一定的遗传学理论依据，从而达到对当地农牧民生活质量的提高。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验样本的采集 本试验选择年龄、个体差异小，健康无病的新疆和田羊400只，作为试验材料。采集血样是和田羊颈部静脉5 mL，用枸橼酸钠抗凝，置于-20 ℃长期冻存。

1.1.2 主要药品和试剂 Taq DNA聚合酶、上下游引物、dNTPs、Marker、Tris平衡酚、6×Loading buffer、10×PCR buffer、EDTA、NaCl、Tris·HCl、SDS、无水乙醇、溴化乙锭、硼酸、二甲苯氰、过硫酸铵、溴酚蓝、琼脂糖、变性剂、聚丙烯酰胺、染色液、超纯水。

1.1.3 主要试验仪器 移液器，ZHJH C1112B型超净工作台，BIOFUGE PRIMOR型低温离心机，IKA MS3型圆周振荡器，JY04S型凝胶成像仪，Mini-6K型微型离心机，PCR仪，DYCP-31CN型琼脂糖水平电泳槽，PowerPac Basic型电泳仪，电冰箱，电子天平，微波炉。

1.2 试验方法

采用常规的酚/氯仿抽提法提取基因组DNA，溶于TE中，-20 ℃保存备用。用1%～1.5%的琼脂糖来检测提取的基因组DNA的效果。根据KRT35基因在GenBank中的序列，用Primer Premier 5. 0 软件独立设计完成引物，由上海生物工程技术有限责任公司合成。F：GGCTCGAAGCTCCATCAC；R：CCGTAGCTGGTAGCAAAGC。

1.2.1 PCR反应条件体系和反应程序 PCR反应条件体系：PCR Green Mixture 10 μL，上游引物（10 pmol/μL）0.6 μL，下游引物（10 pmol/μL）0.6 μL，模板DNA（50 ng/μL）1.5 μL，超纯水7.3 μL，总体积20 μL。

PCR反应的程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，退火温度40 s，72 ℃延伸60s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR产物的SSCP分析方法参考周延清等的方法[8]进行。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：取10 μL PCR产物和7 μL变性剂98 ℃变性10 min，然后冰浴30 min，用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶。电泳300 V 50 mA空跑30 min，预跑10 min，180 V电泳15 h后银染显色。用凝胶成像系统拍照、分析、判定各种基因型。

1.2.2 测序 选择基因型不同的样品，PCR扩增后对PCR原液直接测序。

1.3 数据处理

本试验数据经 Microsoft Excel软件初步处理，并用SPSS 17.0软件系统进行One-way ANOVA 对不同处理间的处理效应进行方差分析。测定结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 提取DNA结果检测

本试验采用酚-氯仿抽提法从和田羊血样品中提取基因组DNA。图1是提取DNA在1%的琼脂糖凝胶中的检测结果，基因组DNA各泳道都有1条清晰的条带，无拖尾现象。

2.2 PCR 扩增结果

按照PCR扩增体系，以和田羊血液中提取的DNA作为模板，在PCR仪中扩增得到PCR产物，然后经1%的琼脂糖凝胶检测。结果表明扩增片段特异性良好，长度约为279 bp，无引物带和其他杂带，可以用于PCR-SSCP分析（图2）。

2.3 PCR-SSCP检测结果