MicroRNA-1271通过靶向mTOR抑制肾癌细胞的增殖和迁移

程力维 刘绪 袁晓露 曾吉

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是一种常见的致死性恶性肿瘤，约占成人恶性肿瘤的5%，是全球十大最常见癌症之一［1］，全球每年报告约270 000例肾细胞癌新病例和116 000例肾细胞癌相关死亡［2］。RCC 可根据不同的生物学特性和治疗方法分为不同的组织学亚型，包括透明细胞癌（KIRC）、乳头状肾癌（KIRP）和嫌色细胞癌（KICH）等［3］，其中肾透明细胞癌是最常见的成人肾脏的致命癌症，占RCC 报告病例的70%～80%，且预后较差［4］。其中如何抑制肿瘤细胞的增殖是RCC 临床治疗面临的主要挑战之一［1］。因此，研发抑制RCC 细胞增殖的新药迫在眉睫。

MicroRNA（miR）被认为是一类进化保守的小非编码RNA 分子，通常长度为18～25 个核苷酸［5］。MicroRNA 在包括细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物学进程中均起着重要的调控作用［6］。因此，microRNA 表达异常与肿瘤的发生和发展密切相关［4］。miR-1271 位于类ADP 核糖基化因子10 基因的一个内含子上，该小RNA 与miR-96 同源，大量的研究证明miR-1271 的表达下降与各种人类癌症的进展相关，如肝细胞癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌和乳腺癌［7-8］等。但是目前尚无有关miR-1271 在肾癌中作用的报导，本研究旨在说明miR-1271 同样与肾癌的发展密切相关，为肾癌的发展机制提供新的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织样本收集2018年8月至2019年5月岳阳市一人民医院病理科11例肾癌患者肿瘤组织及对应的正常组织样本，其中透明细胞癌10例、乳头状肾癌1例，其中男7例，女4例，平均年龄57.4 岁，组织立即在液氮中冷冻并在-80 ℃保存，干冰运输。以上样本排除了接受过化疗、放疗和介入治疗的样本。该项研究得到了本院伦理委员会的批准。

1.1.2 实验材料HEK-293T 细胞系为本实验室之前保存，769-P 和786-O 细胞系购于ATCC，RPMI-1640 培养基、DMEM 培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购于美国Gibco 公司，TRIzol®、PrimeScriptTMRT Master MIX 逆转录试剂盒、TB GREEN®Fast qRTPCR Mix 荧光定量检测试剂盒、Mir-XTMmiRNA First-strand Synthesis and TB GREENTM qRT-PCR和Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System 检测试剂盒均购自日本Takara 公司，转染试剂LipofectamineTM3000 购自美国Invitrogen 公司，本实验所用抗体均购于武汉三鹰生物科技有限公司，miR-1271 mimic、miR-1271 inhibitor 及其对照物均由吉玛基因（上海）合成，细胞培养瓶、6 孔板、24 孔板、Transwell 小室均购于美国康宁公司，pMIR-Report Luciferase 载体购于Ambion 公司，双荧光素酶报告系统试剂购于美国Promega 公司，克隆用酶和试剂均购于庄盟生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染786-O 和769-P 细胞培养条件为RPMI-1640 培养基、10%的胎牛血清和1×浓度的青霉素和链霉素溶液；HEK-293T 细胞培养条件为DMEM 培养基、10%的胎牛血清和1×浓度的青霉素和链霉素溶液，以上细胞均在37 ℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养。细胞培养液每两天更换一次，细胞长满传代。收集处于对数生长期的细胞用于后续实验。

分别将miR-1271 mimic、miR-1271 inhibitor 及其对照NC mimic/inhibitor 转染786-O 细胞，并分别命名为miR-1271 mimic 组，miR-1271 inhibitor 组，NC-mimic 组和NC-inhibitor 组。根据需要对细胞进行瞬时转染处理，具体转染步骤参照转染试剂LipopfectmineTM 3000 的使用说明书进行，简要步骤如下：当培养板中786-O 细胞生长密度达到50%～70%时，使用无血清培养基OPTI-Medium 将microRNA/质粒和转染试剂分别稀释至说明书推荐浓度并轻柔混匀。然后将分别稀释后的转染试剂与microRNA/质粒再次混合，室温静置5 min 后将混合物均匀添加到无血清培养基的细胞中继续培养，4～6 h 后更换为完全培养基培养。转染后24～48 h 收集细胞进行后续实验。

1.2.2 RNA提取和qPCR检测收集组织或细胞，然后按照TRIzol®试剂说明书方法提取总RNA。取2 μg 的总RNA 用Mir-XTM miRNA First-strand Synthesis and TB GREENTM qRT-PCR试剂盒进行逆转录反应得到cDNA，以此cDNA 为模板，应用Mir-XTM miRNAFirst-strand Synthesis and TB GREENTMqRT-PCR 试剂盒进行实时荧光定量PCR 检测miR-1271 的表达量。另外取2 μg 的总RNA 用Prime-Script TM RT Master MIX 逆转录试剂盒进行逆转录反应得到cDNA，以此cDNA 为模板，应用TB GREEN®Fast qRT-PCR Mix 荧光定量检测试剂盒进行实时荧光定量PCR 检测gapdh 和mTOR 的表达量。实时荧光定量PCR 扩增得到循环阈值（Ct 值），采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达数据。实验以U6 为内参检测miR-1271 的表达，以gapdh 为内参检测mTOR 的表达，其中miRNA 检测的下游引物和U6 引物由试剂盒提供，miR-1271 的上游引物序列为5′-CTTGGCACCTAGCAAGCACTCA-3′，gapdh 上游引物序列为：5′-TCATGAAGTGTGACGTGGACATC-3′；下游序列为：5′-CAGGAGGAGCAATGATCTTGATCT-3′。mTOR 上游引物序列为：5′-AGATTTAATGGAGGCCCAGG-3′；下游序列为：5′-GGCCTCTGTTTGGATGTGAT-3′。PCR 反应体系包括PCR Mix 10 μL、模板cDNA 2 μL、上下游引物各1 μL 和ddH2O 6 μL。PCR 扩增条件为95 ℃预变性15 s，95 ℃10 s，60 ℃60 s（收集荧光），共40 个循环。溶解曲线程序为95 ℃60 s，55 ℃30 s，95 ℃30 s，每0.3℃收集一次荧光。

1.2.3 MTT 法检测细胞增殖瞬时转染786-O 细胞24 h 后，收集各处理组细胞并制成细胞悬液，以5 × 103个细胞/孔接种于96 孔板中，每组设置4 个复孔，同时设置空白对照孔。待细胞分别培养24、48、72 及96 h 后，每孔加入10 μL Premix WST-1，继续在培养箱中培养4 h 后，检测450 nm 波长处的吸光度（OD450），并以690 nm 波长处的吸光度值校正，以此反映细胞增殖活性，并绘制细胞增殖曲线。

1.2.4 Transwell检测细胞迁移能力786-O细胞瞬时转染24 h 后，胰蛋白酶消化处理的细胞，用无血清的细胞培养基重悬细胞，分别制备成5 × 105/mL的细胞悬浮液，每个transwell小室中加入100 μL的细胞悬浮液，然后在下室中每孔加入500 μL 含10%胎牛血清的培养基，置于细胞培养箱中继续培养24 h。取出transwell 小室，用棉签擦掉小室内部未穿过底膜的细胞，用多聚甲醛固定细胞15 min，置于0.1% 结晶紫溶液中染色，随机选取10 个视野，于显微镜下计算穿膜细胞数量，每种处理复孔3 次。

1.2.5 miR-1271靶基因预测分别使用target Scan（http：//www.targetscan.org/）和miRDB（http：//mirdb.org/miRDB/）网站预测miR-1271 可能的目标靶基因，并筛选出两个网站同时高评分的靶基因进行实验验证。

1.2.6 载体构建将mTOR 基因的3′-UTR 构建到pMIR-Report Luciferase 载体上（mTOR-3′-UTR），构建载体所用限制性内切酶为Hind III 和Sac I，构建所用引物序列为：mTOR-F：5′- CCCAAGCTTCTGGAGGCCCAGATGTGC-3′；mTOR-R：5′-AAAGAGCTCACATATGTTTAAAATTCTGATGTCATTT-3′。在此基础上将miR-1271 与mTOR 结合的靶位点进行突变设计，设计引物序列为：mTOR-mF：5′- GTTGTATCAGAATAATTTTTGAGGCTATAA-3′ ；mTORmR：5′-AATTCTGATGTCATTTATAGCCTCAAA-3′。PCR 扩增的产物通过同源重组的方法连接转化筛选阳性克隆（mTOR-3′-UTR-mut）。

1.2.7 荧光素酶实验将HEK-293T 细胞均匀接种于24 孔板中，待细胞生长密度达到50%～60%后，将构建的荧光素酶报告质粒（mTOR-3′-UTR，0.5 μg/孔）和突变质粒（mTOR-3′-UTR-mut，0.5 μg/孔）以及pRL-TK 质粒（0.1 μg/孔）共转染至HEK-293T细胞中，转染48 h后，收集细胞，用PBS清洗细胞一次，然后每孔加入100 μL的passive lysis buffer，室温震荡30 min，然后4 ℃12 000 g 离心收集裂解后细胞上清，取250 μL 上清加入等体积的LABII，轻柔混匀，测量吸光值，然后再加入250 μL Stop＆Glo，再次混匀后测量吸光值，检测结束后，根据LABII 和Stop＆Glo 两次荧光值的比值，分析启动子的荧光活性。实验中每个处理重复4 次。

1.2.8 Western blotting 检测mTOR 蛋白的表达细胞转染处理48 h 后使用胰酶消化并收集细胞，使用RIPA 裂解细胞并通过BCA 法定量测定蛋白浓度，100 ℃变性蛋白5 min。配制10%SDS-PAGE凝胶，各组取30 μg 总蛋白上样电泳，电泳完成后将凝胶转移到PVDF 膜上，并用含5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，加入兔抗人GAPDH 抗体或兔抗人mTOR 抗体（稀释比例均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜后，TBST 洗涤膜3 次，然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（稀释比例为1∶3 000），室温反应2 h，然后再使用TBST 洗涤3 次，加入化学发光剂，在暗室中用X 线胶片曝光，常规显影、定影。

1.2.9 miR-1271 在肾癌患者中的生存期分析OncoLnc（http：//www.oncolnc.org/）是一个专业解析TCGA 数据库中mRNA、miRNA 和lncRNA 等基因表达水平与癌症患者生存期的生物信息学网站。将miR-1271 的标准名称“HSA-MIR-1271-5P”输入网站查询，在接下来的页面中选择需要研究的癌症KIRC 和KIRP，选择合适的参数，点击“Submit”得到生存期曲线图和P值。

1.3 统计学方法利用SPSS 19.0 统计分析软件对相关数据进行统计学处理，实验数据采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验，计数资料（Transwell 小室实验）采用χ2检验，实验至少重复3 次。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-1271 在肾癌组织中低表达实时荧光定量PCR 分析miR-1271 在11例肾癌和癌旁组织的表达结果表明，miR-1271 在肾癌组织中表达显著低于正常组织（t= 9.692，P＜0.05，图1A）。另外分别分析miR-1271 在HEK-293T、786-O 和769-P中的相对表达情况，结果表明，miR-1271 在HEK-293T 细胞系中的相对表达量显著高于769-P 和786-O 细胞系中的表达量，差异有统计学意义（t=4.36，P＜0.05；t= 38.938，P＜0.01），其中786-O 中的表达较769-P 更低（t= 4.295，P＜0.05），所以选择以786-O 深入研究（图1B）。

2.2 miR-1271 在肾癌中的表达预测和生存期预测分析OncoLnc 网站分析miR-1271 在KIRC 和KIRP 的表达情况，CoxCoefficent 结果均为负数，说明miR-1271 基因的低表达会增加死亡的风险，“P-Value”结果表明上面的结果分析具有统计学意义。结果见表1和图2所示。

图1 miR-1271 在肾癌组织和不同肾细胞系中的相对表达Fig.1 The relative expression of miR-1271 in RCC tissues and RCC cells

表1 miR-1271 在肾癌中表达的死亡风险预测Tab.1 Prediction of death risk of expression of miR-1271 in RCC

图2 miR-1271 在肾癌中的生存期预测分析Fig.2 Predictive analysis of the survival time of miR-1271 in RCC

2.3 miR-1271 影响786-O 细胞的增殖为了探讨miR-1271 的表达变化对786-O 细胞增殖的影响，分别将NC-mimic、NC-inhibitor、miR-1271-mimic 和miR-1271 inhibitor 瞬时转染786-O 细胞。MTT 实验表明，尽管24 h 时细胞的增殖差异不明显，但从48 h开始，NC-mimic组OD值为（0.46±0.05），过表达组（miR-1271-mimic）OD值为（0.33±0.06）；而NCinhibitor 组OD值为（0.47±0.07），沉默组（miR-1271-inhibitor）OD值为（0.58±0.05），差异具有统计学意义（P＜0.05），72 h 和96 h 的结论与48 h 类似，且786-O细胞的增殖差异具有统计学意义（P＜0.05），可见，miR-1271-mimic 能明显延缓786-O 细胞的增殖，而miR-1271 inhibitor 则会促进786-O 细胞的增殖，结果见图3。

2.4 miR-1271 能抑制786-O 细胞的迁移实验采用transwell技术分析miR-1271对786-O细胞迁移的影响。穿孔细胞计数表明，与NC-mimic 组（140.3± 12.9）相比，miR-1271-mimic 处理组（76.3 ± 19.1）的786-O 细胞数量明显减少；与NC-inhibitor 组（142.4 ± 13.5）相比，miR-1271-inhibitor 组（194.3 ±29）786-O 细胞的数量明显增多，结果表明miR-1271 的表达变化的确影响786-O 细胞的迁移（P＜0.05，图4）。

图3 miR-1271 影响786-O 细胞的增殖Fig.3 MiR-1271affects the proliferation of 786-O cells

2.5 miR-1271 通过靶向mTOR 的3′-UTR 调控表达miR-1271 靶向基因预测结果表明，TargetScan和miRDB 网站同时预测出miR-1271 可以靶向FOXQ1、ZEB1、TWIST1、ALK、CCNG1、HOXA5、CDK1 和mTOR 等基因的3′-UTR，且其中大多数的结合已经被实验证实报道［9］，故本实验主要研究miR-1271 与mTOR 的相互作用。网站预测的miR-1271 与mTOR 的相互作用位点见图3A。另外通过下载NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中不同物种的miR-1271（miR-1271-5P）数据比对表明，miR-1271 序列在人、黑猩猩、大猩猩、猕猴、鼠、牛、猪、犬、羊、马和大棕蝠等哺乳动物中高度保守（图5A）；进一步分析以上物种与mTOR 的3′-UTR结合位点表明，不同物种的miR-1271 与各自物种的mTOR 基因的3′-UTR 结合序列具有高度的保守性（图5B）。以上结果提示，mTOR 是一个进化上保守的mircoRNA，不同物种间均可以通过结合mTOR 基因调控生命活动过程。

图4 miR-1271 对786-O 细胞侵袭能力的影响Fig.4 The effects on 786-O cells invasiveness by miR-1271

分别对HEK-293T 细胞转染mTOR 野生型和突变型质粒，同时交叉转染NC-mimic 和miR-1271 mimic 并分析细胞的荧光素酶活性，实验结果表明，共转染miR-1271 + mTOR-3′-UTR 的细胞荧光素酶活性较野生型显著下降（t=5.068，P＜0.05），将结合位点突变后荧光素酶活性改变不显著（P＞0.05，图5C、D）。

图5 miR-1271 靶向mTOR 基因的3′-UTRFig.5 MiR-1271targeted to the 3′-UTR of mTOR

2.6 miR-1271 负调控mTOR 的表达基因和蛋白水平均表明，过表达miR-1271 能降低786-O 细胞mTOR 的表达，而抑制miR-1271 的表达则可以促进mTOR 的表达（P＜0.05，图6）。

图6 miR-1271 负调控mTOR 的表达Fig.6 MiR-1271 negatively regulates the expression of mTOR

3 讨论

肾癌是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，又称为肾细胞癌或者肾腺癌。肾癌约占成人恶性肿瘤的2%～3%，且男性发病率高于女性，高发年龄50～70 岁，且我国的肾癌发病率呈逐年上升趋势。肾癌的病因不是很明确，已经因素包括遗传、吸烟、肥胖、高血压及抗高血压治疗等［10］。

microRNA 在生命活动过程中起着至关重要的作用，包括细胞增殖、分化、信号转导与致癌等［11］。MicroRNA 通过与目标信使RNA 的3′非翻译区（3′-UTR）结合而成为调节基因表达的重要转录后调节因子，越来越多的证据表明，microRNA的表达变化是影响RCC 增殖的重要因素，其通过靶向下游的抑癌或者促癌基因或者基因通路，进而促进或抑制肿瘤的生长［12］。miR-1271 属于miR-96 的同源基因，两者序列相似，但功能完全不同，目前仅有少量的报道miR-1271 与肿瘤相关，miR-1271 存在miR-1271-5P 和miR-1271-3P 两种形式，目前的研究均集中在miR-1271-5P 的功能上，且均默认miR-1271 即为miR-1271-5P。尽管有报导miR-1271 在头颈癌中上调表达，但目前大多数的报道显示miR-1271 在癌症中下调表达，如LIN 等［13］报导miR-1271 在肝癌中通过结合FOXK2 基因的3′-UTR，进而影响肝细胞癌的增殖和迁移，XIANG等［9］研究表明miR-1271可以通过靶向FOXQ1进而抑制胃癌的侵袭和增殖，LIU 等［14］同样证实miR-1271 可以通过靶向ZEB1 和TWIST1 抑制胰腺癌的侵袭和增殖，LIU 等［15］认为miR-1271 可以通过作用于CCNG1 进而抑制卵巢癌的生长，LI 等［16］研究表明miR-1271 可以通过靶向CDK1 抑制子宫内膜癌的侵袭和诱导细胞凋亡。本研究与这些报道在肾癌细胞中的研究结果一致，miR-1271 均通过抑制促癌基因的表达，进而抑制癌细胞的增殖和侵袭。笔者推测，尽管miR-1271 在少数癌症中起着促癌作用，但整体而言miR-1271 是一个抑癌的microRNA，且miR-1271 在抑制癌症的增殖和迁移中起着重要的作用，其可能成为潜在治疗肿瘤疾病的一个很重要因子。

mTOR 是一种进化上保守的蛋白激酶，由于mTOR 通路的异常信号与各种恶性肿瘤有关，mTOR 蛋白被认为是细胞生长的关键调节因子，并逐渐成为肿瘤治疗的新靶点。mTOR 是细胞自噬的抑制因子，其通过参与PI3K/AKT/mTOR 通路发挥其作用，而mTOR 信号通路解除对肿瘤的调控作用主要是通过抑制凋亡、促进细胞存活、加速细胞周期传递、增强血管生成、促进肿瘤细胞的侵袭和转移［17］。目前已经有大量有关microRNA 可以与mTOR 相互作用进行调控癌症进程的报答，如Ren 等人报道上调骨肉瘤细胞中的miR-144 能够下调mTOR 信号通路的活性，抑制骨肉瘤细胞的增殖，从而提高其对地塞米松诱导的凋亡的敏感性［18］，这与本研究结论类似。与此同时，研究表明mTOR 也可以调控microRNA 的合成，YE 等［19］研究表明，生物体可经由mTOR-Mdm2-Drosha 通路来调节microRNA 的生产以适应环境的改变。

本研究表明，在肾癌中，miR-1271 的表达较癌旁组织低；细胞实验表明，miR-1271 在肾癌细胞中较正常肾细胞下调表达，这种下调表达可以促进癌细胞的增殖和迁移，而在肾癌细胞中过表达miR-1271 则可显著抑制肾癌细胞的增殖和迁移；进一步研究表明，miR-1271 可以通过与靶基因mTOR 的3′-UTR 结合，进而抑制mTOR 的mRNA 和蛋白表达，从而起到抑癌作用。有趣的是，通过分析TCGA 数据库中miR-1271 的表达与肾癌患者的生存期结果表明，miR-1271 的高表达的确会延长肾癌患者的生存期，降低死亡的风险，这结果与本实验的结论完全一致，说明miR-1271 的异常表达的确参与了肾癌的发展过程。

综上所述，miR-1271 可抑制人肾癌细胞786-O的增殖和侵袭，其机制在于miR-1271 通过靶向mTOR 基因的3′-UTR 抑制了mTOR 的生成，进而抑制了肿瘤细胞的生长增殖。当然本实验尚存诸多不足，如肾癌样本量太少，特别是嫌色肾细胞癌没有收集到（TCGA 网站也缺乏KICH 的生存期数据，可能与这种肾癌本身发病率低有关），没有能深入分析比较miR-1271 在不同类型肾癌中的表达情况，还需持续收集样本跟进分析；同时，mTOR 基因只是众多靶向miR-1271 中的一种，更多的靶标基因和更多与肾癌相关的发生机制尚待去发掘研究。