circFAT1在结直肠癌中的表达及其对肠癌细胞迁移和侵袭的影响

陈靖 叶伟标 徐咏强 李妤玲 李仲均

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤。近年来，随着人们生活方式和饮食结构改变，结直肠癌的发病率呈持续上升趋势［1］。结直肠癌起病较为隐匿，相当一部分患者就诊时已出现局部或远处转移。肿瘤转移是导致患者临床治疗失败和预后不佳的主要原因。因而，深入探索结直肠癌转移的分子机制具有重要的意义。环状RNA（circRNA）是一类最近被重新认识的具有特殊结构的内源性非编码RNA［2］。研究表明，circRNA 在肿瘤发生、发展和耐药等过程中均起着重要的作用［3］。在前期研究中，笔者通过基因芯片筛选结直肠癌样本中差异性表达的circRNA，其中circFAT1 的表达显著上调。本研究拟检测circFAT1 在结直肠癌肿瘤组织和肠癌细胞系中的表达情况，分析其与患者临床病理特征和预后的相关性并探讨其中可能的作用机制，为寻求结直肠癌治疗新靶点提供理论基础和实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2010年1月至2014年12月在南方医科大学附属东莞人民医院经手术切除结直肠癌患者85例，其中男49例，女36例，年龄为42～86 岁，平均为（62.5 ± 6.8）岁。所有纳入本研究的病例术前均未接受放化疗或生物免疫治疗，术后经组织病理切片证实为浸润性腺癌。结直肠癌的病理诊断参照2010年版《消化系统肿瘤WHO分类》。本研究经伦理委员会审核批准。

1.2 组织样本和细胞系组织离体15 min 内迅速切取靠近肿瘤边缘处无坏死的癌组织，同时选取距离肿瘤边缘＞5 cm 处的肠黏膜作为配对的癌旁正常肠黏膜组织。其中一份标本装入1.5 mL 的EP 管，置于液氮中保存；另一份标本装入塑料包埋盒，使用10%中性福尔马林缓冲液固定36 h，梯度酒精脱水，石蜡包埋备用。人肠癌细胞株LoVo购自中国科学院上海细胞库。LoVo 细胞株采用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基，在37 ℃、5%CO2及95%空气饱和湿度条件下进行培养。

1.3 RNA提取及Real-time PCR采用TRIzol®Reagent 提取组织和细胞总RNA，利用NanoDrop2000微量分光光度计测定总RNA 含量和浓度。应用PrimeScript®RT Reagent Kit 逆转录合成cDNA；使用TB Green®Fast qPCR Mix 进行实时荧光定量PCR 反应。PCR 反应参数设置如下：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，共40 个循环。circFAT1 上、下游引物序列分别为5′-GAGGACGCCAGAAGAGATGG-3′和5′-GCCAAATGTCTCCCCATTGC-3′。GAPDH 上、下游引物序列分别为5′-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3′和5′-ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT-3′。

1.4 细胞迁移和侵袭实验当细胞生长至80%～90%融合时，用0.05%胰酶消化传代。取对数生长期细胞进行实验。使用LipofectamineTM3000 试剂将siRNA-circFAT1（siRNA-circFAT1 组）、Negative Control（NC 组）转染至LoVo 细胞株，同时仅以LipofectamineTM3000 试剂转染者作为空白对照（Blank 组）。转染24 h 后，用无血清RPMI-1640 培养基制成1 × 105/mL 的细胞悬液。取100 μL 接种于Transwell 上室，在Transwell 下室中加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基。37 ℃培养24 h 后，用棉签擦去上室细胞，4%多聚甲醛固定后，DAPI 染色标记肿瘤细胞核，100 倍镜下随机取5 个视野，计算迁移细胞平均数目。进行细胞侵袭实验时，预先将Matrigel 胶稀释后包被Transwell 上室，室温放置6 h，其余步骤同细胞迁移实验。

1.5 统计学方法采用SPSS 19.0 软件。数据采用均数±标准差或中位数（四分位间距）表示。正态分布数据比较采用t检验。circFAT1 与临床病理参数的关系分析采用Mann-WhitneyU检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

1.6 随访患者通过门诊复查和电话随访，截止时间为2018年6月30日。

2 结果

2.1 circFAT1 在结直肠癌中的表达情况实时荧光定量PCR 检测结果显示，circFAT1 在结直肠癌组织中的表达水平高于癌旁正常肠黏膜组织（P＜0.05，图1）。荧光原位杂交检测结果显示，circFAT1 主要分布在细胞质。

图1 circFAT1 在结直肠癌组织和癌旁正常肠黏膜组织中的表达Fig.1 The expression levels of circFAT1 in CRC and adjacent normal mucosa

2.2 circFAT1 的表达与患者临床病理参数和预后的相关性分析在纳入本研究的85例结直肠癌中，circFAT1 的表达水平与有无淋巴结转移相关（P＜0.05），而与患者性别、年龄、肿瘤发生部位、肿瘤分化程度等无显著的相关性（P＞0.05，表1）。生存分析显示，circFAT1 低表达的患者较circFAT1高表达的患者预后好，差异具有统计学意义（P=0.007 5，图2）。

图2 circFAT1 高表达组与低表达组之间Kaplan-Meier 生存曲线比较Fig.2 Comparision of survival curves（Kaplan-Meier）between circFAT1 low expression group and circFAT1 high expression group

表1 circFAT1 表达与结直肠癌临床病理特征的关系Tab.1 Correlations of circFAT1 expression with clinicopathological features in patients with CRCM（P25，P75）

2.3 siRNA-circFAT1转染效率检测检测结果显示，转染siRNA-circFAT1后LoVo细胞株中circFAT1表达量明显下降，与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05，图3）。

图3 Real-time PCR 检测转染后各组细胞中circFAT1 表达水平Fig.3 The expression levels of circFAT1 in different groups after infection

2.4 circFAT1 对肠癌细胞株迁移和侵袭能力的影响Transwell 小室装置检测细胞迁移和侵袭能力变化，实验结果显示，转染siRNA-circFAT1后LoVo 细胞株的迁移和侵袭能力明显减弱，与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05，图4、5）。

图4 敲低circFAT1 表达对LoVo 细胞迁移能力的影响Fig.4 The effect of siRNA-circFAT1 on LoVo cell migration

图5 敲低circFAT1 表达对LoVo 细胞侵袭能力的影响Fig.5 The effect of siRNA-circFAT1 on LoVo cell invasion

3 讨论

结直肠癌是近年来发病率上升最快的恶性肿瘤之一。根据世界卫生组织发布的肿瘤流行病学统计数据（GLOBOCAN），2018年在全球范围内结直肠癌的新增病例数超过180 万［1］。在我国由于肠癌早期筛查措施尚未普及，约有25%患者就诊时已出现转移。此外，30%～50%患者在行肠癌根治性切除术后仍会发生转移［4］。侵袭和转移是恶性肿瘤最基本的生物学特征，亦是导致肿瘤患者死亡的重要原因之一。针对结直肠癌转移的分子机制和治疗策略已成为当前肿瘤研究领域的热点。

circRNA 是一类具有特殊结构和功能的非编码RNA，可通过充当miRNA 海绵或与RNA 结合蛋白相互作用等方式，参与靶基因的表达调控［5-7］。circRNA 与个体发育、机体代谢以及疾病发生均有着密切的关系［8-12］。早在2013年，HANSEN 等［13］率先鉴定了在人和小鼠脑中以较高丰度存在的环状RNA 分子ciRS-7/CDR1as，发现其具有数量众多的保守性结合位点，可与miR-7 特异性结合，调节靶基因的表达。此后，MEMCZAK 等［14］在对斑马鱼的研究中进一步证实了过表达ciRS-7/CDR1as 可减少中脑体积，影响脑发育。随着研究的不断深入，circRNA 在代谢性疾病和恶性肿瘤的发生发展中的作用受到越来越多的关注［15-19］。目前已有多个研究报道在肝癌、肺癌、乳腺癌等人类肿瘤组织中普遍存在异常表达的circRNA［20-23］。

circFAT1 是一种新近发现的circRNA，其对应基因定位于人类4 号染色体长臂（4q35.2）。在前期实验中，笔者通过基因芯片分析结直肠癌组织及对应癌旁组织的circRNA 表达谱，发现circFAT1在结直肠癌组织中的表达显著上调。利用实时荧光定量PCR 和原位杂交技术对85例不同临床分期的结直肠癌进行检测，验证了circFAT1 在结直肠癌组织中呈高表达状态。分析circFAT1 与患者临床病理参数的相关性，发现结直肠癌组织中circFAT1 表达水平高的患者更容易发生淋巴结转移，circFAT1 表达上调可能与肿瘤转移有关。为此，笔者进一步观察了circFAT1 对肠癌细胞株侵袭和迁移能力的影响；体外细胞实验证实，下调circFAT1 可抑制肠癌细胞株侵袭和迁移。上述结果提示，circFAT1 可能通过促进肿瘤细胞迁移和侵袭参与结直肠癌的恶性演进。