雷替曲塞对人结肠癌细胞SW480增殖、凋亡的影响及其机制

贺许良，黄英，曾良玉，易小龙，李文俊，张树友

1长沙医学院附属株洲市人民医院，湖南株洲 412000；2南华大学附属南华医院

结直肠癌是消化道的常见恶性肿瘤，且随着人们生活水平的不断提高和饮食习惯的改变，近年其发病率呈现出逐年上升的趋势[1,2]。2017年美国癌症协会数据统计，结直肠癌的发病率位居所有恶性肿瘤第三[3]。目前，临床上治疗此类疾病最直接有效的方法仍以手术为主[4,5]，但患者术后5年生存率仅为65%[6]，且不仅复发率及转移率较高，对中晚期患者的治疗效果也较差[7]。为提高此类患者的治疗效果，化疗仍是主要的辅助治疗手段。雷替曲塞作为一种特异性胸苷酸合成酶(TS)抑制剂能够选择性抑制TS，从而对抗肿瘤细胞的增殖，近年被广泛应用于恶性肿瘤的辅助治疗[8～11]，但其对结直肠癌细胞的具体作用机制尚不完全清楚。2017年6月～2019年6月，本研究观察了雷替曲塞对人结肠癌细胞(SW480)增殖、凋亡的影响，以期为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 SW480购自上海一研生物科技有限公司；雷替曲塞(2 mg/支，批号H20090325)购自正大天晴药业集团股份有限公司；RPMI1640培养基(批号350-000-CL)、胎牛血清(批号086150013)购自维森特生物技术(南京)有限公司；兔抗人Bax(批号20151209)、Bcl-2(批号20140608)及Caspase-3单克隆抗体(批号20130908)购自美国ABcam公司；胰蛋白酶、PBS、CCK-8试剂盒、RIPA蛋白裂解液等由碧云天生物技术研究所配制；羊抗兔β-actin内参、BCA蛋白定量试剂盒、PVDF膜、ECL发光检测试剂盒等购自南京凯基生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司设计及合成；细胞培养超净工作台购自上海成永实验室设备有限公司；CO2恒温细胞培养箱购自上海新苗医疗器械制造有限公司；4 ℃低温高速离心机购自德国Beckman公司；自动酶标读数仪、流式细胞仪等购自美国Bio Tek仪器有限公司；RT-PCR仪购自美国Thermo公司。

1.2 细胞培养 ①细胞复苏：超净工作台台面于紫外线照射30 min 后，将SW480冻存管迅速从液氮罐中取出，并置于37 ℃水浴箱中进行解冻。融化后取出冻存管，并用75%乙醇棉球擦拭其外壁。用移液枪吹打细胞液分散细胞后，用吸管吸出细胞液置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中混匀，放在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。②细胞培养与传代：待细胞贴壁后，更换新鲜培养液后继续培养，每3 d更换1次培养液，当细胞生长密度达80%左右且生长状态良好时进行传代培养。弃掉培养液，加入PBS溶液反复冲洗后，加入胰蛋白酶500 μL，待显微镜下观察到细胞变圆、亮度增加且出现明显细胞间隙时吸去胰酶，加入10%胎牛血清终止消化。再次吹打至细胞形成悬液后，加入培养液并按1∶3的比例进行分瓶继续培养。③细胞冻存：待细胞处于对数生长期时，更换新鲜培养液1 d后，按上述细胞传代方式进行细胞消化，消化结束后取细胞悬液1 000 r/min离心5 min，弃上清后加入冻存液，分装至冻存管中，注明细胞种类、代系及冻存时间，分别放入4 ℃冰箱2 h、-20 ℃冰箱3 h、-80 ℃冰箱过夜后置入液氮罐中保存。

1.3 细胞分组 将SW480随机分为A组、B组、C组与对照组，0.25%胰蛋白酶消化并于培养液中重新形成单细胞悬液后置于6孔板中进行培养(每组设定5个复孔)，其中A组SW480培养液中加入0.1 μg/mL雷替曲塞,B组SW480培养液中加入0.5 μg/mL雷替曲塞,C组SW480培养液中加入2.5 μg/mL雷替曲塞,对照组单纯加入等量培养液。

1.4 细胞增殖检测 分别取孵育24、48、72 h各组SW480，采用CCK-8试剂盒严格按说明书操作流程检测细胞增殖活性，并用酶标仪测定450 nm处的光密度(OD)值，每组重复测定5次取平均值，以OD值表示相对细胞增殖活性。

1.5 克隆情况观察 将6孔板内贴壁生长的细胞置于37 ℃、5% CO2条件下培养10 d，采用PBS清洗后，用10%的甲醛固定10 min，行吉姆萨染色；染色后，于倒置显微镜下观察细胞克隆情况，并对>50个的细胞进行计数后计算克隆形成率(每组重复测定5次取平均值)。克隆形成率(%)=细胞克隆数/接种细胞数×100%。

1.6 细胞Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA检测 采用实时荧光定量PCR技术。细胞孵育72 h后取出6孔板，弃去培养基，加入TRIzol Regent，吹打至细胞全部裂解并静置5 min后加入0.2 mL氯仿作用3 min； 4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，取上层清液加入0.5 mL异丙醇，静置10 min后4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，弃去上层清液；加入75%乙醇1 mL混匀后4 ℃ 7 500 r/min离心5 min，弃去上层清液，风干10 min；加入DEPC水20 μL，55 ℃金属浴10 min；提取样品分别检测其在260 nm及280 nm波长吸光度(A)值，A260/A280值在1.8～2.0视为RNA提取合格；在冰上按照顺序将RNA、Oligo(dT)18引物、DEPC水、Reaction Buffer等加入PCR管中混匀后42 ℃恒温孵育60 min、70 ℃恒温孵育5 min；准备PCR 板，配置总体积为5 μL的反应体系(其中上游和下游引物各10 pmol)，95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s预变性40个循环。采用2-ΔΔCt法计算Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA的相对表达量(每组重复测定5次取平均值)。

1.7 细胞Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白检测 采用Western Blotting法。细胞孵育72 h后，弃去细胞培养液，采用PBS冲洗3次，加入预冷细胞裂解液裂解、混匀，并冰浴15 min；冰浴后，依次匀浆，12 000 r/min离心15 min；提取总蛋白，采用紫外分光光度计测定总蛋白浓度，绘制蛋白浓度标准曲线。取蛋白上样与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混匀后100 ℃加热10 min进行蛋白变性，置于-20 ℃环境下保存备用。SDS-PAGE凝胶制作后加入等体积蛋白上样电泳、转膜、封闭，置于4 ℃环境下孵育一抗过夜；一抗孵育后，PBST洗膜3次，然后加入二抗，室温下孵育60 min；二抗孵育后，PBST洗膜3次，并曝光显影；最后用图像分析软件Image J检测蛋白条带灰度值(每组重复测定5次取平均值)。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较 见表1。

表1 各组细胞孵育不同时间OD值比较

注：与本组24 h相比，aP<0.05；与对照组同时点相比，bP<0.05；与A组同时点相比，cP<0.05。

2.2 各组细胞克隆形成率比较 细胞孵育10 d后，对照组、A组、B组、C组SW480克隆形成率分别为(81.03±5.32)%、(45.83±4.28)%、(31.05±3.75)%、(22.99±2.63)%，组间两两比较，P均<0.05。

2.3 各组细胞Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA表达比较 随着雷替曲塞浓度的增加，SW480 Bax及Caspase-3 mRNA表达升高，Bcl-2 mRNA表达降低，详见表2。

2.4 各组细胞Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白表达比较 随着雷替曲塞浓度的增加，SW480 Bax及Caspase-3蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低，详见图1，表3。

表2 各组细胞Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA表达比较

注： 与对照组相比，aP<0.05；与A组相比，bP<0.05；与B组相比，cP<0.05。

图1 各组Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达条带图

表3 各组细胞Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白表达比较

注： 与对照组相比，aP<0.05；与A组相比，bP<0.05；与B组相比，cP<0.05。

3 讨论

流行病学研究显示，全球每年新发结直肠癌病例高达93万，严重威胁人类健康，且大部分患者在发现肿瘤时已存在转移，采取手术治疗一般很难根治，必须采取化疗的方法延长患者的生存期[12，13]。雷替曲塞作为一种抗代谢药物，因其副作用较小、效果显著,被广泛应用于结直肠癌的辅助治疗，但有关其具体作用机制的相关文献较少。

肿瘤细胞的增殖及克隆形成反映了细胞转移能力的强弱[14]。有学者研究发现，雷替曲塞可将胃癌细胞S期的比例上升，从而将细胞进程阻滞在G0/G1期，诱导癌细胞凋亡，并且明显抑制人胃癌细胞MGC-803裸鼠移植瘤生长[15]。本研究发现，随着雷替曲塞浓度的增加以及干预时间的延长,SW480的增殖速度减慢，且在浓度达到一定程度后，该现象不再明显。此外，不同浓度的雷替曲塞对SW480癌细胞株的增殖和克隆体形成影响不同，克隆形成率随雷替曲塞浓度的增加依次减少。

细胞凋亡的过程可概括为凋亡诱导、调控执行及效应三个阶段。研究显示，细胞凋亡的发生与线粒体、死亡受体和内质网密切相关[16]。如启动型Caspase可结合特异辅助因子，激活效应型下游Caspase，从而降解细胞内蛋白，最终导致细胞发生不可逆性死亡[17]；位于线粒体膜、内质网膜和核膜上的Bcl-2蛋白，作为Caspase-3的直接作用底物，可被其裂解为促凋亡功能片段，从而瀑布样促进细胞的凋亡[18]。周正等[19]发现，SH2B1在肝癌细胞株HepG2中高表达，沉默SH2B1表达可调控凋亡相关蛋白表达促进肝癌细胞株HepG2细胞凋亡，抑制肝癌细胞生长速度。张九成等[20]研发发现，甘草查尔酮A作用于人结肠癌HCT116和SW480细胞，能显著上调促凋亡蛋白Bax和Caspase-3蛋白活化片段Cleaved-Caspase-3的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，随着甘草查尔酮A浓度及时间的延长，人结肠癌细胞的增殖抑制率增大，呈现浓度和时间依赖性，可能的作用机制为激活氧化应激和调控Bcl-2、Bax与Caspase-3信号通路。封革等[21]研究发现，雷替曲塞干预微卫星高度不稳定性(MSI-H)结肠癌细胞株后，促凋亡蛋白Caspase-3、Bax等的表达明显增加，而抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达明显降低。本研究结果显示，随着雷替曲塞浓度的增加，Bax及Caspase-3蛋白及mRNA的表达明显升高，Bcl-2蛋白及mRNA表达明显降低，与上述研究结果相似。

综上所述，雷替曲塞可通过调节SW480 Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白及其mRNA的表达激活细胞凋亡通道，抑制细胞增殖，诱导结肠癌细胞凋亡，这将为临床治疗提供重要理论依据，其具体作用机制仍需要进一步深入研究。