胃癌组织中lncRNA-PVT1、Atg5的表达变化及临床意义

韦斌,黄俏莹,黄顺荣，钟晓刚，麦威，牙韩清，朱州，张贵年

1 广西壮族自治区人民医院，南宁 530021；2 广西医科大学第一附属医院

胃癌属于常见的消化道恶性肿瘤，其病死率在恶性肿瘤中位居第二，而中国的胃癌病死率约占世界的43%[1]。胃癌早期无明显症状，易被患者忽视，就诊时绝大多数患者病情已进展到中晚期，预后较差，5年生存率仅为10%[2]。既往研究[3]表明，早期诊断胃癌可以使患者的5年生存率达到80%～90%。因此，掌握胃癌病变的调控机制进行早期诊断和靶点治疗对延长患者生存时间意义重大。长链非编码RNA(LncRNA)尽管不能编码蛋白质，但可以调节基因表达，参与染色质修饰，调控蛋白质活性，且在时间、空间以及组织上均具有特异性[4]。长链非编码RNA-浆细胞瘤变体易位1(LncRNA PVT1)是LncRNA的一种类型，在正常组织中低度表达，然而在转化细胞系的表达明显提高，在癌细胞增殖、侵袭以及转移中具有促进作用[5～7]。研究[8]发现，自噬过程的异常激活会破坏机体内的细胞器及蛋白质，为肿瘤细胞增殖和浸润提供条件，自噬相关基因5(Atg5)的异常表达是自噬过程异常激活的关键因素。此外，异常表达的Atg5能够影响细胞内新陈代谢及凋亡速率，使细胞内环境紊乱，是恶性肿瘤形成和发展的关键步骤。LncRNA PVT1和Atg5是否共同参与癌变进展需临床进一步研究[6]。本研究将探讨LncRNA PVT1和Atg5在胃癌组织及其癌旁正常组织的表达差异，并分析其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析广西壮族自治区人民医院于2016年1月～2019年2月收治的103例胃癌患者的临床及病理资料。纳入标准：所有患者符合《中国常见恶性肿瘤诊治规范》[9]且经术后病理确诊为胃腺癌；既往无胃部手术史或放化疗史；基本资料完整。排除标准：合并其他恶性肿瘤者；合并胃部其他严重疾病，如胃穿孔、慢性萎缩性胃炎以及胃间质瘤等；肝肾功能明显异常者；存在自身免疫性疾病或免疫系统异常。其中男59例、女44例，年龄≥60岁54例、<60岁49例，有淋巴结转移者24例、无淋巴结转移者79例，低分化者9例、中分化者51例、高分化者43例，TNM分期Ⅰ期42例、Ⅱ期35例、Ⅲ期20例、Ⅳ期6例，肿瘤直径≤5 cm者61例、>5 cm者42例。所有患者接受胃癌根治术治疗。术中切取胃癌组织及其对应癌旁5 cm以上正常组织，将其放入液氮中暂时保存，术后统一保存于-80 ℃冰箱中。本研究获得医院伦理委员会批准，且参与研究患者均签署知情同意书。

1.2 LncRNA PVT1、Atg5检测方法 应用实时荧光定量PCR技术。各取胃癌组织及其癌旁正常组织50 mg，均加入1 mL的TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)，根据其操作步骤提取总RNA。用2.0 μg总RNA合成cDNA，通过PrimeScript 1st strand cDNA合成试剂盒完成操作。LncRNA PVT1和Atg5定量表达选用凯杰公司SYBR®Green PCR Kit试剂盒进行检测，严格遵守说明书完成操作。LncRNA PVT1的引物合成条件为42 ℃ 1 h、70 ℃ 5 min，正向引物为5′-CAACCAGGACCGGGTCAAACG-3′，反向引物为5′-GCCTCGGACATGACCTTCCACT-3′，其长度为92 bp，退火温度控制在59 ℃。内参基因β-actin的正向引物为5′-CCCAGCACAATGAAGATCAAGATCAT-3′，反向引物为5′-ATCTGCTGGAAGGTGGACAGCG-3′，其长度为101 bp，退火温度控制在55 ℃。PCR反应条件：预变性在95 ℃时维持5 min，变性在95 ℃时维持10 s，退火及延伸在55 ℃维持30 s。Atg5的引物合成条件为37 ℃ 1 h、95 ℃ 5 min，正向引物为5′-GCCATCAATCGGAAACTCAT-3′，反向引物为5′-CAGCCACAGGACGAAACAG-3′。内参基因U6的正向引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反应条件为预变性95 ℃ 15 min，变性94 ℃ 15 s，退火55 ℃ 30 s，延伸70 ℃ 30 s。以上所有引物由上海生工生物工程有限公司负责合成，反应均为40个循环，每个样本均进行3次检测。采用2-ΔΔCt法计算LncRNA PVT1、Atg5相对表达量。

2 结果

2.1 胃癌组织及其癌旁正常组织中LncRNA PVT1和Atg5表达比较 胃癌组织及其癌旁正常组织中LncRNA PVT1相对表达量分别为6.27±1.43、1.34±0.21，Atg5相对表达量分别为2.31±0.34、1.05±0.14，胃癌组织中LncRNA PVT1、Atg5相对表达量均较癌旁正常组织高(P均<0.01)。

2.2 胃癌组织中LncRNA PVT1、Atg5表达与患者临床病理参数的关系 见表1。

表1 胃癌组织中LncRNA PVT1、Atg5表达与患者临床病理参数的关系

2.3 胃癌组织中LncRNA PVT1与Atg5表达的相关性 胃癌组织中LncRNA PVT1的表达和Atg5的表达呈正相关(r=0.553，P=0.000)。

3 讨论

胃癌的发生与饮食习惯、环境因素、基因突变及调控密切相关[10]，具体机制极为复杂，目前仍缺乏便捷有效的早期诊断指标，因此多数患者确诊时胃癌已进展到中晚期。随着基因测序技术的不断成熟，近年来众多研究[11,12]表明，某些基因失调能够增加胃癌易感性，如LncRNA、微小RNA以及c-myc等，这些基因在细胞分化、增殖以及凋亡的调节中起关键作用。非编码RNA含量约占基因组整体的98%，尽管不能编码蛋白质，但能够调控mRNA拼接及基因转录，对多种疾病的发生起重要作用。LncRNA在非编码RNA中含量最多，具有修饰染色质、干扰细胞质中核糖核酸稳定性以及调节微小RNA活性的作用。LncRNA对细胞周期和细胞侵袭及转移均具有重要影响，且参与调控多种肿瘤信号通路，如mTOR、Wnt、Notch以及NF-κB等[13]。由于LncRNA检测具有价格实惠、可重复以及操作简便等优势，目前DD3PCA3、MALAT-1以及HOTAIR等多种LncRNA已被作为早期诊断和评估预后的标志物。LncRNA PVT1位于染色体8q24.21，处于c-myc上游，其内包含6种微小RNA。LncRNA PVT1通过促进细胞周期蛋白依赖性激酶4的表达，使原癌基因c-myc表达上调，进而导致肿瘤细胞无限增殖[14]。既往研究[7]表明，发生恶性肿瘤(直肠癌、非小细胞肺癌等)时LncRNA PVT1常出现异常扩增及拷贝数增加。本研究结果显示，胃癌组织中的LncRNA LncRNA PVT1相对表达量较癌旁正常组织提高，与Kong等[15]研究结果一致。分析原因可能为,胃癌组织中的癌细胞刺激巨噬细胞和淋巴细胞分泌大量的细胞因子(如IL-6)，经信号转导通路传递后使LncRNA PVT1表达上调[16]。本研究结果表明，胃癌组织中LncRNA PVT1的表达与淋巴结转移和TNM分期有关，表明LncRNA PVT1可以促进胃癌发展，反映胃癌的TNM分期及有无淋巴结转移，间接评估患者病情。其机制可能为LncRNA PVT1能够激活Zeste同系物2(Ezh2)，而Ezh2已被证实为癌基因，其表达上调可以诱导p15和p16调控系统活化，促进癌细胞增殖及分化，最终导致癌症进展恶化[17]。此外，LncRNA PVT1能够抑制PDCD4蛋白转录，从而阻碍正常细胞基因转录后发挥生物功能，同时，PDCD4蛋白表达降低后会导致对金属蛋白酶9抑制作用减弱，从而促进癌细胞的增殖及侵袭[16]。

自噬是一种通过溶酶体降解细胞器及膜蛋白质的细胞程序性死亡，对机体具有一定的保护作用[18]。然而，异常激活自噬过程可以破坏机体内正常的细胞器及蛋白质，为肿瘤细胞增殖和浸润提供条件。Atg5位于染色体6q21上，通过共价结合Atg12对自噬过程的延伸阶段具有重要调控作用。据相关研究[19]报道，Atg5的突变或异常表达可以损伤DNA并降低基因组的稳定性，进而增加肿瘤发生风险。本研究结果显示，胃癌组织中Atg5相对表达量较癌旁正常组织高，Atg5的表达与分化程度和TNM分期有关。表明Atg5可以评估胃癌的分化程度及判断胃癌分期。其原因可能为胃癌组织内表达上调的泛素特异肽酶22(USP22)通过使沉默信息调节因子(sirt1)去泛素化，进而稳定sirt1表达，而sirt1能够促进Atg5和Atg7去乙酰化，进而诱导异常自噬，损伤细胞内的DNA及蛋白质，增强了癌细胞的侵袭能力[20]。此外，Atg5通过与泛素化的Atg7和Atg10共价结合，从而激活自噬过程，促进癌细胞内大量生成ATP并激活线粒体内的β-氧化，使癌细胞营养代谢活跃，加速其分裂及分化，促进癌细胞侵袭及迁移[19]。

本研究表明，胃癌组织中LncRNA PVT1的表达与Atg5的表达呈正相关。表明LncRNA PVT1和Atg5可能具有协同作用，二者共同诱导胃癌的形成和进展。其机制可能是胃癌组中的LncRNA PVT1能够直接结合Atg5，诱导Atg5表达。既往研究[21]报道，LncRNA PVT1过表达时能够使Atg5上调，而抑制LncRNA PVT1时则Atg5下调。然而由于本研究样本数量及实验设施的限制，LncRNA PVT1和Atg5互相调控的具体机制尚不明确，需要进一步探究。

综上所述，LncRNA PVT1和Atg5在胃癌组织中均高表达，二者相互作用共同影响胃癌的发生和进展，可能成为胃癌早期诊断和药物靶点治疗的标志物。