ZSCAN18启动子区甲基化水平与头颈肿瘤的关系

杨爱芳，庞振文，黄愉峰, 韦正波，曾先捷

广西医科大学附属肿瘤医院，南宁 530021

头颈肿瘤是全球第六大恶性肿瘤，其在中国发病率也逐年升高。尽管近年来对头颈肿瘤的治疗方法有了很大的进展，但患者预后仍较差，其5年生存率为40%～50%，且晚期肿瘤患者生存率更低[1]。导致头颈肿瘤患者治疗效果较差的一个重要的原因是对该肿瘤的发病机制还不完全清楚。因此，探索头颈肿瘤发病的分子机制对于寻找更有效的治疗方法具有重要的意义。研究已表明，肿瘤发病过程中伴随着大量的基因异常表达，而基因的表达与其甲基化水平存在密切关系[2,3]。DNA甲基化是表观遗传学重要组成部分，可导致肿瘤分子异常表达。因此，研究肿瘤分子的甲基化水平，对于了解该基因在肿瘤发病过程中的作用有重要的意义[4]。ZSCAN18位于染色体19q13，有11个外显子，在人体大部分组织中均有表达。既往有研究表明，ZSCAN18与肝癌[5]、肾细胞癌[6]的发病相关，且在胃肠道肿瘤中其甲基化水平明显升高[7]，提示ZSCAN18甲基化水平与这些肿瘤的发病存在密切关系。然而，ZSCAN18在头颈肿瘤发病中的作用鲜有报道。癌症基因组图谱(TCGA)数据库是目前最大的肿瘤高通量数据库，该数据库收录了包括头颈肿瘤在内的多种肿瘤的多组学数据。因此，本研究通过分析TCGA数据库的ZSCAN18数据，研究ZSCAN18及其启动子区甲基化水平与头颈肿瘤发病的关系，并探索ZSCAN18甲基化水平与头颈肿瘤预后的关系，为头颈肿瘤诊断、预后相关标志物的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 数据下载和提取 检索和下载TCGA数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)中头颈肿瘤相关的ZSCAN18 mRNA数据、ZSCAN18启动子区CpG岛的甲基化水平数据。ZSCAN18启动子区共有9个CpG岛，分别是cg02348449、cg03145999、cg05616010、cg06442489、cg10659886、cg12405983、cg14231297、cg17408527、cg18693673。同时下载TCGA数据库中头颈肿瘤的生存时间数据和临床病理参数数据，提取患者的年龄、性别、TNM分期和临床分期数据。

1.2 ZSCAN18启动子区甲基化水平与头颈肿瘤关系分析 使用GEPIA在线工具(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)[8]，比较头颈肿瘤组织和癌旁组织中ZSCAN18及其甲基化水平，并分析两者相关性；分析ZSCAN18 mRNA和启动子区各个CpG岛甲基化水平的相关性；分析ZSCAN18 mRNA和启动子区各个CpG岛甲基化水平与患者总生存时间的关系；分析ZSCAN18 mRNA和启动子区各个CpG岛甲基化水平与临床病理参数的关系。

2 结果

2.1 头颈肿瘤组织中ZSCAN18表达比较 头颈肿瘤及其对应的癌旁组织中ZSCAN18 mRNA的相对表达量分别为2.03±0.95、3.67±1.06，两者相比P<0.05。

2.2 头颈肿瘤组织中ZSCAN18启动子区甲基化水平比较 对ZSCAN18启动子区中的9个CpG岛取平均值。头颈肿瘤及其对应的癌旁组织中ZSCAN18启动子区平均甲基化水平分别为0.57±0.21、0.42±0.07,两者相比P<0.001。

2.3 头颈肿瘤组织中ZSCAN18 mRNA和启动子区甲基化水平的相关性 相关分析显示，ZSCAN18启动子区平均甲基化水平(0.57±0.21)与ZSCAN18的mRNA(2.03±0.95)表达并无相关性(r=-0.038,P=0.400)。

使用log2法对ZSCAN18 mRNA相对表达量进行校正后，再分别与启动子区的9个CpG岛甲基化水平进行相关分析，结果显示cg02348449甲基化水平与ZSCAN18 mRNA表达呈正相关(r=0.173，P<0.001)，而cg17408527甲基化水平与ZSCAN18 mRNA表达呈负相关(r=-0.091，P<0.004)。

2.4 ZSCAN18 mRNA和启动子区CpG岛甲基化水平与头颈肿瘤患者总生存时间的关系 将ZSCAN18 mRNA和启动子区CpG岛的中位值作为分割点，计算各个指标表达水平与患者生存时间的关系，结果显示高表达ZSCAN18 mRNA的患者其生存时间较长[(991.65±94.08)d vs.(896.38±81.27)d,P=0.044]，而3个CpG岛的结果相反，即高甲基化水平者其生存时间较短,cg02348449:(863.04±70.55)d vs. (1 024.47±101.06)d,P<0.05;cg03145999:(884.45±89.91)d vs.(1 003.63±89.85)d,P<0.05;cg12405983:(850.01±87.74)d vs.(1038.21±88.08)d，P<0.05。

Cox回归分析结果显示，cg02348449(HR=0.65，95%CI：0.50～0.85，P<0.05)、cg03145999(HR=0.66，95%CI：0.47～0.91，P<0.05)为患者独立预后指标，见表1。

表1 头颈肿瘤患者预后的COX回归分析

2.5 ZSCAN18 mRNA和启动子区CpG岛甲基化水平与头颈肿瘤临床病理参数的关系 根据生存分析结果，选取ZSCAN18 mRNA和cg02348449、cg03145999、cg12405983进行临床病理分析，结果显示ZSCAN18 mRNA和cg12405983甲基化水平在头颈肿瘤患者的不同年龄、性别、TNM分期和临床分期差异无统计学意义；cg02348449甲基化水平在患者的不同性别、T分期和M分期存在差异(P均<0.05)；cg03145999甲基化水平在患者的不同性别、N分期和M分期存在差异(P均<0.05)。见表2。

3 讨论

DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化与基因表达呈负相关，不仅启动子区高甲基化与基因表达呈负相关，基因内部的甲基化与基因表达也存在着弱的负相关，而启动子区低甲基化与转录活性正相关。因此，DNA甲基化是调控基因表达的重要机制，也是一些遗传病以及肿瘤发病的重要机制[9]。与其他肿瘤的发生类似，人头颈肿瘤是由多种遗传学和表观遗传学修饰共同作用而引起的。

表2 ZSCAN18 mRNA和启动子区CpG岛甲基化水平与头颈肿瘤临床病理参数的关系

既往已有一些研究报道了数个基因甲基化与头颈肿瘤发病的关系。赵锦成等[10]研究了H-钙黏素(CDH13)在人头颈部鳞癌细胞系SCC10A和PCI-37B中的表达水平及其启动子区域的甲基化状态，发现与正常组织比较，SCC10A和PCI-37B中CDH13的mRNA和蛋白表达均降低，肿瘤细胞中CDH13基因甲基化水平高于口腔黏膜正常组织。Imai等[11]研究发现，SALL2在头颈肿瘤组织中呈高表达状态，且可作为判断患者预后的重要标志。目前ZSCAN18在肿瘤发病中作用的报道较少，现有的研究表明，ZSCAN18在多种恶性肿瘤中呈高度甲基化状态，在对应的正常或癌旁组织中甲基化水平较低。Mitchell等[12]使用PCR技术证实了ZSCAN18在结直肠癌组织甲基化水平比癌周正常组织明显升高。Andresen等[13]报道ZSCAN18的甲基化水平可以与CDO1、DCLK1等基因组成基因标签来准确诊断胆管癌。这些研究提示ZSCAN18在肿瘤诊断和预后判断方面的重要潜在价值。

本研究通过分析TCGA数据库中头颈肿瘤的数据，发现ZSCAN18在头颈肿瘤组织中呈低表达状态，提示ZSCAN18表达在肿瘤的发病过程中被抑制，有可能是一个抑癌基因。对其启动子区的甲基化水平分析表明，该基因在头颈肿瘤组织中甲基化水平高于癌旁组织，提示ZSCAN18表达降低可能是因为其启动子区发生高度甲基化发生的。为了进一步探索甲基化位点(CpG岛)与其基因表达的关系，本研究还分析了各个CpG岛与ZSCAN18 mRNA表达的相关性，结果显示，头颈肿瘤组织中cg02348449甲基化水平与ZSCAN18 mRNA表达呈正相关，而cg17408527甲基化水平与ZSCAN18 mRNA表达呈负相关，提示这两个CpG岛均可以调控ZSCAN18 mRNA表达水平，但其具体作用机制还需要进一步研究。

既往已有研究报道，基因甲基化位点与肿瘤的预后有密切关系，可作为判断患者预后的指标。为了探索ZSCAN18及其甲基化位点与头颈肿瘤预后的关系，本研究也进行了相应的分析。结果显示，ZSCAN18 mRNA高表达的患者生存时间高于低表达的患者，而在ZSCAN18的9个CpG岛中，有3个(cg02348449、cg03145999、cg12405983)与患者的生存时间相关，高甲基化水平者其生存时间较短，Cox回归分析提示cg02348449、cg03145999可作为判断头颈肿瘤患者的重要预后指标。根据生存分析的结果，本研究还探讨了ZSCAN18 mRNA和这3个CpG岛与患者临床病理参数的关系，结果表明cg02348449和cg03145999这两个CpG岛与肿瘤患者的性别和TNM分期有关系，而ZSCAN18 mRNA和cg12405983与肿瘤临床病理参数无显著关系，这进一步提示未来的研究应更关注cg02348449和cg03145999这两个CpG岛在头颈肿瘤发病中的作用。

综上可见，ZSCAN18在头颈肿瘤发病中表达下降，这可能是由于其甲基化位点高度甲基化导致的。ZSCAN18的mRNA和cg02348449、cg03145999、cg12405983与头颈肿瘤患者的生存时间有关，而cg02348449和cg03145999与患者性别和TNM分期有关，可作为未来探索与头颈肿瘤发病的原因和治疗靶点进行深入研究。