苦瓜皂苷对人恶性黑素瘤SKMEL-2细胞增殖凋亡及JAK/STAT5通路的影响

黄翠敏, 叶秀群, 骆月姬

(广州中医药大学第一附属医院药学部, 广东 广州 510405)

恶性黑色素瘤是主要发生于皮肤体表及粘膜的恶性肿瘤，预后差，易转移，发病率约占皮肤恶性肿瘤的6.8%～20%，近年来其发病率增长迅速，且呈年轻化趋势，严重威胁居民身心健康[1]。苦瓜皂苷是提取自葫芦科苦瓜属蔓性草本植物苦瓜的皂苷类物质，具有降血糖、抗病毒、抗肿瘤、抗艾滋病、提高免疫力等多种生物活性，可抑制肿瘤的发生、发展[2]。苦瓜皂苷可下调C/EBPβ及TGF-β1表达，上调Caspase3及P53表达，抑制人肺癌A549细胞的增殖和迁移，并促进其凋亡[3]。苦瓜和苦瓜叶提取物处理大鼠，可抑制胰腺癌的发生、发展，可作为预防胰腺癌的措施，因而预计苦瓜皂苷可抑制人恶性黑素瘤SKMEL-2细胞的生长。JAK/STAT5信号可调控细胞增殖、凋亡、分化等生理过程，当STAT5磷酸化因G6PD缺陷而降低时，可促进人黑色素瘤A375细胞凋亡[4,5]。STAT5在上皮-间充质转换(EMT)中起重要的调节作用，SR-BI基因缺失可导致STAT5活性降低，抑制黑色素瘤的转移，总之，JAK/STAT5信号在人黑色素瘤细胞的增殖、凋亡、转移中发挥着重要作用，而苦瓜皂苷对其的影响目前还未知，本文通过苦瓜皂苷处理体外培养的人恶性黑素瘤SKMEL-2细胞，探讨其对SKMEL-2细胞生长及JAK/STAT5通路的影响。

1 材料与方法

1.1试剂与材料：SKMEL-2细胞购自上海名劲生物科技有限公司；苦瓜皂苷购自上海源叶生物科技有限公司；顺铂购自山东齐鲁制药厂；DMEM培养基、胎牛血清FBS、胰蛋白酶-EDTA消化液、100×青链霉素混合液购自Solarbio公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒、兔源GAPDH、Bax、caspase3一抗，鼠源Bcl-2一抗，羊抗鼠二抗，羊抗兔二抗购自美国Cell Singaling Technology公司；兔源JAK、p-JAK、STAT5、p- STAT5一抗，购自美国Abcam公司；RIPA蛋白裂解液、CKK-8试剂盒、BCA试剂盒购自上海碧云天公司等。

1.2仪器：Elx800酶标仪购自美国Bio-Rad公司；CytoFLEX流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司；双人单面超净工作台购自Thermo公司；电泳仪、制冰机购自北京六一仪器厂等。

1.3方 法

1.3.1培养基的配制及细胞培养:完全培养基的配制：向DMEM基础培养基中加入10%胎牛血清、100U/mL青、链霉素，上下震荡混匀。冻存的人恶性黑素瘤SKMEL-2细胞，于39℃水浴中快速解冻，离心后接种于含5mL完全培养基的25cm2培养瓶内，置于37℃、5%CO2、95%湿度恒温细胞培养箱中培养，当细胞长到80%以上时，以1∶3的比例传代。

1.3.2CKK-8实验:从前期预实验结果可知苦瓜皂苷在48h的IC50值为4.57mg/mL，因而在筛选合适药物作用浓度和时间时，以5mg/mL为准，加减2.5mg/mL设置浓度，分别检测人恶性黑素瘤SKMEL-2细胞在24h、48h、72h的细胞增殖抑制率，方法如下：以DMEM基础培养基溶解苦瓜皂苷配制为20mg/mL的储备液备用。1.3.1中的传代细胞以6×104个/mL的密度接种在96孔板中，培养过夜，向96孔板中加入苦瓜皂苷储备液处理SKMEL-2细胞，使终浓度分别为1、2.5、5、7.5、10mg/mL，每个浓度设置4个孔作为重复，同时选定4个孔设置为对照组。药物作用24、48、72h后每孔加入CKK-8试剂继续培养2h，采用全自动酶标仪测定450nm波长下各孔吸光度(optical density，OD)，计算苦瓜皂苷不同浓度对细胞的增殖抑制率，公式为：增殖抑制率(%)=(对照组OD值-药物处理组OD值/对照组OD值)×100%，实验重复三次。

1.3.3药物及细胞处理和分组:顺铂是临床上常用的治疗人恶性黑色素瘤的抗癌药，在抗肿瘤研究中也常作为阳性对照药，本研究即选用顺铂作为阳性对照，终浓度为5μmoL/L。1.3.1中的传代细胞，以完全培养基重悬混匀后，将其随机分为三组：对照组、苦瓜皂苷组、顺铂组接种于60mm培养皿中，置于37℃、5%CO2、95%湿度恒温细胞培养箱中培养24h后以5mg/mL浓度的苦瓜皂苷、5μmoL/L的顺铂处理细胞，48h后分别以0.25%胰酶消化后收集各组细胞备用。

1.3.4细胞存活率及凋亡情况检测:1.3.1中的传代细胞，以完全培养基重悬混匀后，将其随机分为三组：对照组、苦瓜皂苷组、顺铂组以0.6×105个/mL的密度接种在96孔板中，培养过夜后，药物处理SKMEL-2细胞48h，每孔加入CKK-8试剂继续培养2h，采用全自动酶标仪测定450nm波长下各孔OD值，计算各组细胞的相对存活率，公式为：相对存活率(%)=药物处理组OD值/对照组OD值×100%，实验重复三次。以流式细胞技术检测细胞凋亡率，1.3.3中的各组细胞，加入完全培养基后，混匀计数，取约含有1×106个细胞的细胞混悬液至一个EP管中，1000r/min离心5min，细胞沉淀以PBS溶液漂洗2次，1000r/min离心5min，细胞沉淀中加入200μL的Binding Buffer及10μL的ArmexinV-FITC轻轻震荡，使之充分混匀，室温下避光反应15min，1000r/min离心5min，细胞沉淀中加入300μL的Binding Buffer和5μLPI轻轻混匀，室温下避光反应15min，1000r/min离心5min，细胞沉淀中加入PBS后，轻轻震荡使之成为均匀的单细胞悬液，然后以流式细胞仪检测，采用Muticycle AV软件分析结果，实验重复三次。

1.3.5免疫印迹(western blot，WB)实验:向1.3.3中的各组细胞加入RIPA蛋白裂解液提取总蛋白，以BCA试剂盒测定蛋白总浓度，根据测定结果调整各组蛋白浓度相同，根据目的蛋白分子量配制适宜浓度的SDS-PAGE胶，各组取20μg蛋白样品加入胶孔中，在电泳仪中进行电泳，湿转转移全部分离蛋白至硝酸纤维膜上，根据目的蛋白分子量裁剪目的蛋白条带置于小盒中，加入5%的脱脂奶粉，室温封闭2h，分别加入适宜浓度的一抗兔源GAPDH、JAK、p-JAK、STAT5、p-STAT5、caspase3抗体，鼠源Bcl-2抗体，4℃孵育过夜，以TBST漂洗3次，根据一抗种属分别加入适宜浓度的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗，室温封闭2h，采用化学发光试剂显色，在凝胶成像仪中观察并拍摄蛋白条带，以Image Lab软件分析蛋白的相对表达量，实验重复三次。

2 结 果

2.1苦瓜皂苷对SKMEL-2细胞增殖的影响:苦瓜皂苷对SKMEL-2细胞增殖有抑制作用，并和浓度及作用时间相关，药物作用48、72h其抑制作用比24h高，而药物作用48、72h其抑制作用基本相同；浓度为1、2.5、5、7.5、10mg/mL的苦瓜皂苷都能抑制SKMEL-2增殖，其抑制作用随浓度升高而增强，但在药物作用48、72h后，浓度达到5mg/mL时抑制作用趋于稳定。结果显示，5mg/mL的苦瓜皂苷处理SKMEL-2细胞48h后，其对细胞的增殖抑制率达(58.91±4.54)%，见图1。因此，本实验选择浓度为5mg/mL的苦瓜皂苷处理SKMEL-2细胞48h来进行后续研究。以5mg/mL浓度的苦瓜皂苷、5μmoL/L的顺铂处理SKMEL-2细胞48h后，与对照组比较，苦瓜皂苷组及顺铂组细胞相对存活率明显降低(P<0.05)；苦瓜皂苷组与顺铂组相比，相对存活率无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。统计量为：F=73.726，P=0.000。见图2。

图1 不同浓度的苦瓜皂苷对SKMEL-2细胞增殖的影响

2.3苦瓜皂苷对SKMEL-2细胞凋亡相关蛋白的影响:与对照组比较，苦瓜皂苷组及顺铂组细胞Bcl-2表达明显降低(P<0.05)，caspase3、Bax表达明显升高(P<0.05)；苦瓜皂苷组与顺铂组相比，各蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。Bcl-2统计量为：F=44.388，P=0.000；caspase3统计量为：F=16.537，P=0.004；Bax统计量为：F=18.003，P=0.003。见图5、6。

图2 苦瓜皂苷对SKMEL-2细胞相对存活率的影响

注：A：对照组；B：苦瓜皂苷组；C：顺铂组。“a”表示与对照组比较，P<0.05

2.2苦瓜皂苷对SKMEL-2细胞凋亡的影响:与对照组比较，苦瓜皂苷组及顺铂组细胞凋亡率增加(P<0.05)；苦瓜皂苷组与顺铂组相比，凋亡率无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。统计量为：F=57.518，P=0.000。见图3、4。

图3 苦瓜皂苷对SKMEL-2细胞凋亡的影响

图4 苦瓜皂苷对SKMEL-2细胞凋亡率的影响

注：A：对照组；B：苦瓜皂苷组；C：顺铂组。“a”表示与对照组比较，P<0.05

图5 免疫印迹检测各组细胞凋亡相关蛋白的表达

图6 苦瓜皂苷对SKMEL-2细胞凋亡相关蛋白表达的影响

注：A：对照组；B：苦瓜皂苷组；C：顺铂组。“a”表示与对照组比较，P<0.05

2.4苦瓜皂苷对SKMEL-2细胞JAK/STAT5通路相关蛋白的影响:与对照组比较，苦瓜皂苷组及顺铂组细胞p-JAK/JAK、p-STAT5/STAT5明显降低(P<0.05)；苦瓜皂苷组与顺铂组相比，p-JAK/JAK、p-STAT5/STAT5无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。p-JAK/JAK统计量为：F=11.903，P=0.008；p-STAT5/STAT5统计量为：F=53.982，P=0.000。见图7、8。

图7 免疫印迹检测各组细胞JAK/STAT5通路相关蛋白的表达

图8 苦瓜皂苷对SKMEL-2细胞JAK/STAT5通路相关蛋白表达的影响

注：A：对照组；B：苦瓜皂苷组；C：顺铂组。“a”表示与对照组比较，P<0.05

3 讨 论

人恶性黑素瘤(MM)的临床治疗包括手术切除、化疗、放疗、免疫治疗等，根据病情和肿瘤分期的不同，治疗方法的选择也不同，早期MM治疗首选手术切除，中晚期或具有高危因素的早期MM还应辅助化疗放疗、免疫治疗等其他治疗手段，但放疗、化疗易产生耐药性，且有恶心呕吐、毛发脱落、血细胞减少等各种副作用，因此寻找新的治疗方法具有重要的临床意义[6]。苦瓜总皂苷是从苦瓜中提取的一种皂苷类混合物，其对肿瘤的生长具有抑制作用，苦瓜提取物能抑制转录因子核转录因子κB(NF-κB)的活性，进而诱导乳腺癌细胞凋亡，因而预计苦瓜皂苷对人恶性黑素瘤生长具有抑制作用[7]。本文CKK-8实验结果显示，苦瓜皂苷可抑制SKMEL-2细胞增殖，并和浓度及作用时间相关，药物作用48h、72h其抑制作用比24h高，而药物作用48h、72h其抑制作用基本相同；浓度为1、2.5、5、7.5、10mg/mL的苦瓜皂苷都能抑制SKMEL-2增殖，其抑制作用随浓度升高而增强，但在药物作用48h、72h后，浓度达到5mg/mL时抑制作用趋于稳定，其增殖抑制率达(58.91±4.54)%，因此，本实验选择浓度为5mg/mL的苦瓜皂苷，以5μmoL/L的顺铂做阳性对照，处理SKMEL-2细胞48h来进行后续研究，与control组比较，苦瓜皂苷组及顺铂组细胞相对存活率明显降低，揭示苦瓜皂苷可抑制SKMEL-2增殖，降低其存活率。

细胞凋亡是机体自主调控的自主、有序的死亡过程，有多种基因及蛋白参与其中，caspase-3、Bcl-2、Bax是和细胞凋亡相关的关键蛋白，激活并上调caspase-3，可激活下游的凋亡级联反应，最终促使细胞凋亡；Bcl-2蛋白抑凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2相比Bax表达较多时，两者可结合形成异源二聚体，抑制细胞凋亡，Bcl-2相比Bax表达较少时，Bax自身之间会形成同源二聚体，促进细胞凋亡[8]。纯化后的脐青蛋白可抑制JAK/STAT信号通路的活性，明显上调caspase-3的表达，下调Bcl-2的表达，抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖，诱导其凋亡[9]。(2'Z,3'E)-6-溴靛玉红-3'-肟衍生物(6BIO)可抑制JAK1-STAT3信号转导通路，进而抑制小鼠B16恶性黑色素瘤细胞的增殖，可知JAK/STAT5信号在人恶性黑素瘤的增殖、凋亡中发挥着重要作用，而苦瓜皂苷对JAK/STAT5信号的作用目前还未知，本文研究结果显示，与control组比较，苦瓜皂苷组及顺铂组细胞p-JAK、p-STAT5、Bcl-2表达明显降低，细胞凋亡率、caspase3表达、Bax表达明显升高，JAK、STAT5表达无明显变化，表明苦瓜皂苷可以抑制JAK/STAT5信号的激活，促进人黑色素瘤细胞SKMEL-2的凋亡，揭示下调JAK/STAT5信号可能是苦瓜皂苷抑制人黑色素瘤细胞生长的作用机制。

综上所述，苦瓜皂苷可抑制JAK/STAT5信号激活，上调caspase-3、Bax的表达，下调Bcl-2的表达，抑制人黑色素瘤细胞SKMEL-2增殖、促进其凋亡，但本文未做动物体内的整体实验，还存在不足，本文研究结果表明抑制JAK/STAT5信号激活可能是苦瓜皂苷抑制人黑色素瘤细胞生长的作用机制，但其确切的作用机制还需使用JAK/STAT5信号的激动剂和抑制剂进行对照验证，进行深入研究。