维生素C在急性大剂量乙醇摄入后颅脑损伤中作用的研究

伍宵 高飞 董金千 茆翔 刘佰运

在发达和发展中国家，颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI）仍然是导致死亡和残疾的主要原因之一[1-3]。研究证实，饮酒是加重TBI后继发性脑损伤的重要危险因素[4-6]。众所周知，TBI后活性氧（reactive oxygen species，ROS）与脑水肿密切相关，而TBI前的乙醇摄入会产生更多的ROS并降低抗氧化活性。这些研究均表明，抗氧化剂可能会预防或延缓摄入乙醇后的TBI引起的继发脑损伤，而维生素C（vitamin C，VitC）的抗氧化作用在许多体外实验中已得到证实[7-9]。本课题组的前期工作证实，急性乙醇摄入会通过水通道蛋白-4抗体（aquaporin-4，AQP-4）的过表达加剧细胞毒性脑水肿，并且VitC在治疗急性TBI中起保护作用[4]。已知细胞色素P450（cytochrome，CYPs）可代谢肝脏中的乙醇，并且细胞色素P4502E1抗体（cytochrome P4502E1，CYP2E1）在乙醇相关的神经炎症和氧化应激中也起着重要作用[10]。本实验使用VitC对乙醇后的TBI大鼠进行干预，以期探究VitC的作用及其可能存在的机制。

材料与方法

一、实验材料

VitC（纯度＞99%，Sigma，美国），溶解于生理盐水中。于注射前配制注射用药；10%水合氯醛；BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京碧云天科技有限公司）；AQP-4（ab9512，Abcam公司，英国）；基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）抗 体（ab38899，Abcam公司，英国）；紧密连接蛋白Occludin抗体（ab31721，Abcam公司，英国）；CYP2E1（ab28146，Abcam公司，英国）。实验动物：40只成年雄性SD大鼠（285～305 g/只）购自安徽医科大学实验动物中心。

二、实验方法

1.实验分组：所有的实验动物伦理都得到了安徽医科大学实验动物中心的授权，符合动物伦理。实验大鼠自由饲养在动物笼中，室温为24℃。实验大鼠随机分成4组，每组10只，于打击前1 h分别腹腔注射3 g/kg乙醇（10 mL/kg）或同等剂量的生理盐水：打击+生理盐水组（TBI+only）、打击+乙醇+生理盐水组（TBI+EtOH）、打击+VitC组（TBI+VitC）、打击+乙醇+VitC组（TBI+EtOH+VitC）。本课题组前期实验证实VitC对假手术组大鼠不产生影响，并且VitC具有量效关系，因此假手术组的实验数据并未列出[9]。本实验的VitC剂量为600 mg/kg。于打击后24 h测定神经功能评分、脑水肿、血脑屏障完整性，以及AQP-4、MMP-9和Occludin表达量。

2.可控性皮层打击：实验大鼠用10%的水合氯醛麻醉（400 mg/kg），并使用本课题组实验室改进的CCI打击器[11]。连续监测直肠内温度保持实验大鼠体温为37℃±0.5℃。实验大鼠固定于立体定向仪上。正中剪开皮毛，在右侧冠状缝前，中线旁1 mm，磨开一大小为6 mm×6 mm的骨窗。打击仪（PCI 3000，Hatteras Instruments，Inc.，美国）使用的打击参数为：速度：2.0 m/s，打击深度：2.5 mm，接触时间：150 ms，使用的打击头直径为4 mm。打击后，使用骨蜡将骨瓣回纳（图1），丝线缝合头皮。不同实验组在打击后15 min和6 h给药，腹腔内注射生理盐水或VitC。

图1 打击区域示意图及骨蜡封闭骨瓣示意图

3.神经功能评估：神经功能评估实施于打击后24 h。使用通用的16分神经功能评分量表。

4.脑水肿的测定：测定脑的含水量。利用干湿称质量法测量打击侧大鼠大脑半球的含水量从而测定脑水肿程度。大鼠在打击后24 h处死，右侧大脑半球测量质量获得湿质量。脑组织置于120℃烤箱中烘烤24 h，获得干质量。脑组织含水量的计算公式：（湿质量-干质量）/湿质量×100%。

5.血脑屏障完整性的测定：通过测定伊文氏蓝在脑内的含量而测定血脑屏障完整性，2%的伊文氏蓝在打击后22 h通过大鼠股静脉注射入体内，剂量为4 mg/kg，平衡2 h之后，实验大鼠被灌注处死，分离左右大脑半球。打击侧大脑半球放置于5 mL的甲酰胺中室温下萃取3 d。萃取液在12 000 g下离心15 min，清液上机利用分光光度计测量，激发光波长为620 nm，发射光波长为680 nm。脑组织置于120℃烤箱中烘烤24 h。伊文氏蓝含量表达单位为μg/g。

6.免疫印迹：分离打击侧的皮层组织，使用RIPA裂解液匀浆（50 mmol/L Tris，pH 7.0，150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100）。在4℃匀浆30 min，12000 g离心20 min。加入等量的蛋白，SDS-PAGE胶孔中，以80 V恒压电泳，至蛋白Marker跑至凝胶下缘时停止，并转膜。洗膜，5%牛奶封闭2 h，4℃过夜孵育抗体：抗AQP-4抗体（1∶500；Abcam，Cambridge，英国），抗MMP-9抗体（1∶1000；Abcam，Cambridge，英国），抗Occludin抗体（1∶250；Abcam，Cambridge，英国），抗Cytochrome P4502E1抗体（1 ∶5000；Abcam，Cambridge，英国）。TBST洗膜3次，每次15 min；室温下孵育二抗1 h。而后TBST洗膜3次，每次15 min；使用Bio-Rad Quantity One成像系统化学发光成像。

三、统计学分析

采用Graphpad8.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（）表示，3组间比较采用单因素方差分析（F检验）；组间两两比较采用两独立样本t检验，检验水准α=0.05。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

一、4组大鼠TBI后24 h的神经功能损伤评分、脑含水量及伊文氏蓝含量

打击24 h后，相比TBI-only组，TBI+EtOH组的神经功能损伤评分、脑含水量和伊文氏蓝含量明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；而与TBI+EtOH组相比，TBI+VitC组、TBI+EtOH+VitC组的神经功能损伤评分、脑含水量和伊文氏蓝含量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与TBI+VitC组相比，TBI+EtOH+VitC组的脑含水量和伊文氏蓝含量明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。伊文氏蓝在脑组织中大体病理学示意图见图2。

表1 颅脑损伤24 h后各组大鼠神经功能损伤评分、脑含水量及伊文氏蓝含量的表达水平比较

图2 颅脑损伤后24 h伊文氏蓝在脑组织中大体病理学示意图

二、4组 大 鼠TBI后24 h的MMP-9、AQP-4、CYP2E1及Occludin的含量

打击24 h后，与TBI-only组相比，TBI+EtOH组的MMP-9和AQP-4蛋白表达量明显升高，Occludin蛋白表达量明显减少；而TBI+VitC组和TBI+EtOH+VitC组MMP-9和AQP-4蛋白表达量明显减少，Occludin蛋白表达量明显增加，差异均有统计学意义（P<0.05）。与TBI+EtOH组相比，TBI+EtOH+VitC组MMP-9和AQP-4蛋白表达量明显降低，Occludin蛋白表达量明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。与TBI+EtOH组相比，TBI+EtOH+VitC组CYP2E1表达量明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。详细信息见图3。

图3 MMP-9、AQP-4、CYP2E1和Occludin在不同分组中的蛋白表达量

讨论

TBI的致残和致死率在各类创伤中居第一位，给社会带来了巨大的负担，尤其乙醇后相关的TBI，治疗效果差，死亡率高，预后差，社会负担较重。目前国际对此类研究还偏重于临床研究，基础研究较少，尤其很少涉及有关乙醇后相关的TBI干预的系统性基础性研究。醉酒容易情绪激动，易发生酒后驾车、挑衅斗殴等伤害性事件，醉酒患者受伤后因缺乏自我保护，可能导致二次伤害造成合并伤，即使是较轻的TBI也将导致颅内不可逆的严重损伤。因此研究乙醇后TBI后的继发性脑损伤及保护作用就显得尤为重要[5,11,12]。

本课题组的前期实验已表明VitC在治疗TBI中有保护作用[8,9]。本实验研究结果显示，打击24 h后，TBI+EtOH组的神经功能损伤评分、脑含水量和伊文氏蓝含量明显增加，VitC干预后，各项指标明显减少，组间差异具有统计学意义；与TBI+EtOH组相比，TBI+EtOH+VitC组的CYP2E1表达减少，AQP-4和MMP-9的含量降低，Occludin含量增高，组间差异具有统计学意义。此实验采用各种行为学及指标，系统地阐述了VitC在治疗此类复杂TBI患者中的潜在优势。前期工作已表明急性摄入高剂量乙醇后，TBI大鼠中AQP4的表达水平显著上调，乙醇加剧了TBI后的细胞毒性脑水肿，与缺氧诱导因子-1的表达量增加有关[4]。

VitC是一种抗氧化剂，可以保护其他抗氧化剂，防止自由基对人体的伤害[7]。本实验结果表明，急性乙醇摄入加剧了TBI后细胞毒性脑水肿，CYP2E1表达明显增加，而在给予VitC后，大鼠的CYP2E1表达减少。基于以上结果，可以猜测VitC中可能含有CYP2E1抑制物，可通过P450减少AQP-4和MMP-9的激活，增加Occludin蛋白的表达，降低血脑屏障紧密连接的分解及完整性的破坏，减少血脑屏障的开放及减轻脑水肿。MMP-9是一种可以选择性降解细胞外基质的内肽酶以及细胞基底层等细胞外基膜的蛋白酶体，其过表达不仅加剧血脑屏障的破坏，而且加剧脑水肿程度[6,12-14]。AQP-4的表达量与脑水肿的产生及程度密切相关。AQP-4蛋白的增加，不仅加重了脑水肿，而且导致血脑屏障结构进一步被破坏，加重继发性脑损伤[4,12]。Occludin蛋白是一种存在于脑内皮细胞的紧密连接跨膜蛋白，作用是维持紧密连接复合体结构的稳定，而这种紧密连接复合体也是血脑屏障的核心结构[12,13,15]。在TBI中，CYP2E1的存在导致产生更多的氧自由基，进一步加重了继发性脑损伤。乙醇和TBI均能加重这一系列破坏过程[16]。本实验研究结果表明，给予VitC治疗后，通过干扰CYP2E1的表达，从而改变了乙醇相关的氧化应激反应，减少了血脑屏障的破坏，减少了脑水肿，减缓了神经元的死亡，减轻了乙醇后TBI后继发性脑损伤的进一步发展，最终促进了神经功能的恢复。

综上所述，急性乙醇摄入加剧了TBI后细胞毒性脑水肿，而VitC可通过P450减少AQP-4和MMP-9的激活，增加Occludin蛋白的表达，减少血脑屏障紧密连接的分解及完整性的破坏，降低血脑屏障的开放及减轻脑水肿，最终改善神经功能，这将对乙醇如何增强TBI后脑水肿并确定潜在治疗靶点提供了更好的理解，并发现了VitC在治疗这一系列急重症中的前景。