急性减压缺氧对大鼠氧化应激损伤的研究

高迎春，孟盼盼，郭建魁，何 蕾，曹琪璐，张 俊

高原地区空气中氧气的含量随着海拔高度的增加而降低，青藏高原的平均含氧量仅为海平面的60%[1]。当人快速进入高原地区时，空气中的氧分压下降，血氧饱和度迅速降低，造成人体组织器官的缺氧性损伤，甚至引发急性高原病，严重时导致死亡[2]。在高原缺氧环境下，机体内的自由基代谢发生紊乱，自由基的含量异常增高，引起脂质过氧化，损伤生物大分子和细胞膜结构，导致氧化-抗氧化系统功能失衡，进而使机体发生氧化性损伤[3-4]。近年来，随着高原经济建设的发展和交通设施的完善，越来越多的高原从业者和旅游者需要进入高原地区，因此，明确高原病的发病因素及防护机制，提高急进高原人群的缺氧耐受力至关重要[5-6]。本研究通过采用大型低压低氧动物实验舱模拟高原海拔8000 m，对缺氧12、24、48 h大鼠心、脑组织进行病理观察和氧化应激相关生化指标测定，评价高原缺氧不同时间对心、脑组织损伤的影响，以期为高原疾病防治研究提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级Wistar雄性大鼠40只，体重180～220 g。购自兰州大学动物科。合格证号：SCXK(京)2016-0006。饲养于联勤保障部队第九四〇医院动物实验科。

1.2仪器 FLYDWC50-ⅡA型低压低氧动物实验舱(中航工业贵州风雷航空军械有限责任公司)；SpectraMax i3全自动荧光酶标仪(美国Molecular Devices 公司)；IMS-20制冰机(常熟雪科电器有限公司)；水浴锅(上海医疗器械七厂)；高速离心机(德国Appendorf公司)；L486型-806超低温冰箱(海尔Biochemical仪器有限公司)；Vortex涡旋仪(海门市其林贝尔仪器)；DK-8A型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)。

1.3药品与试剂 甲醛(分析纯，成都金山化学试剂有限公司)；生理盐水(四川科伦药业，批号:C215101607)；10%水合氯醛溶液(解放军第一医院，批号：20150523)；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(批号：20161219)；考马斯亮蓝法蛋白试剂盒(批号：20161203)；BCA法蛋白试剂盒(批号：20161212)；乳酸(LD)试剂盒(批号：20170106)；过氧化氢(H2O2)试剂盒(批号：20161219)；过氧化氢酶(CAT)试剂盒(批号：20161220)；谷胱甘肽(GSH)试剂盒(批号：20161209)；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒(批号：20161220)；总超氧化物歧化酶(T-SOD)试剂盒(批号：20161221)；糖原试剂盒(批号：20161230)；一氧化氮(NO)试剂盒(批号:20161216);一氧化氮合酶(NOS)试剂盒(批号：20161219)。以上试剂盒均由南京建成提供。

1.4缺氧方法 取SPF级健康Wistar雄性大鼠，适应饲养3 d后随机分为常氧对照组、缺氧12、24、48 h组，每组10只。常氧对照组大鼠不缺氧，其余3组置于大型低压低氧动物实验舱中，以10 m/s速度减压上升至海拔8000 m高度，分别缺氧12、24、48 h。缺氧相应时间完成后，以20 m/s速度将氧舱海拔降至3500 m，将大鼠立即处死，取心、脑组织检测相关指标。

1.5心肌组织和脑组织显微结构观察 每组各取2只大鼠取其心、脑组织，经生理盐水漂洗放入10%甲醛溶液中浸泡1周后，将样品送至联勤保障部队第九四〇医院病理科，进行石蜡包埋，组织切片，染色以及光镜观察。

1.6心肌组织和脑组织超显微结构观察 每组各取2只大鼠，取其心、脑组织，并立即投入新鲜固定液中(2.5%戊二醛)固定1周后，取出用锋利刀片切成1 mm的小块。样品送往兰州大学基础医学院电镜室，进行浸透与包埋工作以及电镜观察。

1.7心肌组织和脑组织生化指标测定 取大鼠心、脑组织标本，准确称取各组织重量后，加入9倍冰生理盐水，使用组织匀浆器在冰水浴中匀浆，3500 r/min，离心10 min，取上清于-80℃保存待测。指标测定方法按照说明书要求进行。

2 结果

2.1减压缺氧对大鼠心、脑组织显微结构的影响 常氧对照组大鼠脑组织结构正常，细胞形态完好，血管清晰可见；与常氧对照组比较，缺氧后大鼠脑组织血管、神经细胞和胶质细胞周围间隙明显扩大，细胞核染色质不均匀，呈空泡状或网状，间质内空泡状结构增多，且损伤程度随着缺氧时间的延长而加重。见图1。常氧对照组大鼠心组织结构正常，细胞形态完好，心肌纤维排列整齐；与常氧对照组比较，心肌组织损伤随着缺氧时间的延长而加重，肌细胞肿胀，肌纤维增粗排列不整齐，胞核增大深染，缺氧24 h后，心肌细胞空泡变性；至缺氧48 h后损伤尤其严重，肌纤维中部分肌原纤维溶解。见图2。

2.2减压缺氧对大鼠心、脑组织超显微结构的影响 常氧对照组大鼠神经元细胞核膜平整光滑，异染色质少，常染色质多，细胞器多，且状态良好；与常氧对照组比较，缺氧组大鼠神经细胞组织损伤随着缺氧时间的延长而加重，缺氧12 h后，血管间隙肿胀，神经元细胞正常；缺氧24 h后损伤较12 h严重，线粒体肿胀，内质网扩张，血管间隙肿胀；缺氧48 h后损伤最严重，血管外周间隙肿胀，细胞核凋亡早期内质网扩张。见图3。常氧对照组大鼠心肌纤维排列密集有序，肌丝连接处整齐，肌丝明暗带交替明显，宽度正常，线粒体圆形，形态良好，膜完整；与常氧对照组比较，缺氧12、24 h损伤较轻，缺氧12 h后，肌纤维轻度溶解；缺氧24 h后，血管轻度肿胀，肌质网扩张；至缺氧48 h可见明显损伤，线粒体肿胀，受损严重的部分出现收缩带，肌节缩短。见图4。

图1 4组大鼠脑组织病理观察结果(HE×400)

A.常氧对照组；B.缺氧12 h组；C.缺氧24 h组；D.缺氧48 h组

图2 4组大鼠心组织病理观察结果(HE×400)

A.常氧对照组；B.缺氧12 h组；C.缺氧24 h组；D.缺氧48 h组

图3 模拟高原缺氧不同时间对脑组织神经元细胞的影响(×10 000)

A.常氧对照组；B.缺氧12 h组；C.缺氧24 h组；D.缺氧48 h组

图4 模拟高原缺氧不同时间对心肌肌纤维的影响(×10 000)

A.常氧对照组；B.缺氧12 h组；C.缺氧24 h组；D.缺氧48 h组

2.3减压缺氧对大鼠心、脑组织氧化应激相关生化指标的影响 与常氧对照组比较，缺氧组大鼠心组织CAT活力随缺氧时间延长呈先降低后逐渐升高的趋势，缺氧12 h降低显著，缺氧24、48 h高于缺氧12 h，且缺氧48 h高于缺氧24 h(P<0.05，P<0.01)。与常氧对照组比较，缺氧组心组织H2O2含量呈先升高后逐渐降低的趋势，缺氧12、24 h升高显著，缺氧48 h低于缺氧12、24 h(P<0.05，P<0.01)。与常氧对照组比较，缺氧组心组织GSH含量在缺氧24、48 h时显著降低，且缺氧24、48 h低于缺氧12 h(P<0.05，P<0.01)。与常氧对照组比较，缺氧组心组织T-SOD活力呈先降低后逐渐升高的趋势，缺氧12 h降低显著，且缺氧48 h高于缺氧12 h(P<0.05，P<0.01)；MDA含量呈先升高后降低趋势，但仅缺氧24 h组高于常氧对照组(P<0.05)。与常氧对照组比较，缺氧组脑组织CAT活力呈先降低后逐渐升高的趋势，缺氧12、24 h显著降低，但缺氧48 h开始升高，且高于缺氧12、24 h(P<0.05)。缺氧组脑组织H2O2含量随缺氧时间延长逐渐升高，缺氧48 h高于常氧对照组(P<0.05)，与缺氧12、24 h组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与常氧对照组比较，缺氧组脑组织GSH含量随着缺氧时间的延长逐渐降低(P<0.05)，但各缺氧组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。缺氧组脑组织T-SOD活力呈降低趋势，缺氧24、48 h低于常氧对照组和缺氧12 h(P<0.05,P<0.01)；MDA含量缺氧12 h后逐渐升高，但仅缺氧48 h高于常氧对照组，且高于缺氧12、24 h组(P<0.05,P<0.01)。见表1。

表1 4组大鼠心、脑组织氧化应激相关生化指标变化

注：CAT为过氧化氢酶,GSH为谷胱甘肽，H2O2为过氧化氢,T-SOD为总超氧化物歧化酶，MDA为丙二醛；与常氧对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与缺氧12 h组比较，cP<0.05，dP<0.01；与缺氧24 h组比较，eP<0.05，fP<0.01

3 讨论

当机体长时间暴露于缺氧环境中，会使机体的内源性抗氧化酶活性下降，打破生物体内自由基产生和清除之间的动态平衡，从而自由基攻击体内生物大分子，导致机体一系列氧化性损伤[7-8]。当机体吸入的氧气不足时，心脏便会启动代偿机制，使血管扩张，加速心率和加大心脏动力，增加单位时间内的血流量，从而提高机体的摄氧能力[9]。但同时也会加重心脏的负担，导致心脏病、心力衰竭等。大脑是机体内耗氧量最大的器官之一，缺氧环境对脑代谢、脑自动调节、脑血流速度、脑血管反应、脑功能和形态都有一定的影响，因此大脑不可避免地会受到氧化应激的影响[10]。本研究HE染色结果显示，大鼠脑组织缺氧后可见明显损伤，脑组织血管、神经细胞和胶质细胞周围间隙明显扩大，细胞核染色质不均匀，呈空泡状或网状，间质内空泡状结构增多，但缺氧12、24、48 h损伤无明显差异；心组织损伤随着缺氧时间的延长而加重，肌细胞肿胀，肌纤维增粗排列不整齐，胞核增大深染，心肌细胞空泡变性，肌纤维中部分肌原纤维溶解。组织病理学研究发现，缺氧后大鼠脑组织神经元细胞超显微结构受到严重损伤，损伤程度随着缺氧时间的延长而加重，血管间隙肿胀，线粒体肿胀，细胞核凋亡。缺氧12、24 h对大鼠心肌纤维的超显微结构损伤较小，至缺氧48 h后，心肌纤维受到严重损伤，线粒体肿胀，受损严重的部分出现收缩带，肌节缩短。

在正常生理情况下，机体内产生的少量自由基可随时被体内的抗氧化物酶清除，二者处于动态平衡。但当机体处于缺氧环境时，由于氧(O2)含量低，体内电子积累量高，更多的电子攻击可用O2基态形成超氧阴离子(O2-)，进而通过链式反应形成H2O2和羟基自由基(OH-)[11]，体内产生的大量活性氧(ROS)攻击生物膜中的酶和不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，形成以MDA为主的多种过氧化物，对机体造成损伤[12-13]。同时机体的抗氧化能力防御体系包括酶促与非酶促两个体系均受到干扰，使抗氧化酶活性(CAT、T-SOD)和GSH含量降低[14]，最终导致氧化-抗氧化系统功能失衡。本研究结果显示，随着缺氧时间的延长心组织H2O2、MDA含量呈先升高后降低趋势，CAT、T-SOD活力呈先降低后升高趋势，GSH含量缺氧12 h后开始显著降低，其中H2O2缺氧12 h、MDA缺氧24 h升高较明显，CAT、T-SOD缺氧12 h降低较明显，GSH缺氧24 h降低较明显；脑组织H2O2含量呈逐渐升高趋势，MDA、CAT呈先降低后升高趋势，T-SOD活力和GSH含量呈逐渐降低趋势，其中H2O2、MDA缺氧48 h升高较明显，CAT缺氧24 h下降较明显，GSH、T-SOD缺氧48 h下降较明显。

综上所述，本实验主要从病理学观察、氧化/抗氧化系统两方面探讨了模拟海拔8000 m不同时间对大鼠心、脑组织损伤的影响，且损伤程度与缺氧时间有关，随着缺氧时间的延长，脑组织损伤逐渐加重。但是心组织在缺氧暴露12 h时损伤较严重，可能是缺氧损伤与机体防卫机制相互对抗的结果。