木香乙醇提取物对缺氧小鼠肝脏保护作用研究

靳婉君，郝 颖，樊鹏程，杨林鹏，马慧萍

当低海拔地区人群进入高原后，由于高原的低压、低氧等环境因素影响，机体对低氧环境的适应能力不全而发生的综合征称为高原病。缺氧时对人体劳动学习记忆都会发生影响[1]，且氧气对生命活动有着重大的意义，当机体无法在氧化剂分子的生产和利用之间建立平衡时，会发生氧化应激[2]，在氧化应激期间活性氧(ROS)的过量产生可能导致蛋白质、DNA和脂质损伤，引起细胞损伤[3]。氧供缺乏会损伤线粒体氧化磷酸化和线粒体功能[4]，同时缺氧会导致线粒体膜电位降低,呼吸链电子传递受阻[5]，能量代谢障碍，从而导致线粒体的功能障碍。本课题组前期筛选发现木香提取物给药后在常压密闭实验中小鼠存活时间延长率最高，故用70%乙醇提取木香药材，给药干预模拟缺氧小鼠，检测线粒体膜电位，以及与三羧酸循环和氧化磷酸化相关的关键酶，从线粒体功能角度探讨木香对肝脏的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1实验动物：SPF级Balb/c雄性小鼠，体重(20±2)g，购买并饲养于联勤保障部队第九四〇医院动物实验科，合格证号：SYXK(军)2017-0047。

1.1.2药物：木香饮片(榆中县农牧工商联合公司隆兴中药材饮片加工厂，批号：20170923)，木香饮片粉碎，用4倍量70%乙醇浸泡过夜，超声提取1 h，过滤，重复2次，合并滤液，浓缩，冷冻干燥，得木香70%乙醇提取物。

1.1.3试剂：线粒体膜电位试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，产品货号：CA310)，乙酰唑胺原料药(武汉远城科技发展有限公司，纯度≥98%)。异柠檬酸脱氢酶(NADP)、ATP、Coenzyme Q1、硫辛酰胺脱氢酶、NADP+等均购买于SIGMA公司。

1.1.4仪器：FLYDWC50-ⅡA小型低压低氧动物实验舱(中航工业贵州风雷航空军械有限责任公司)；Spectramax i3型全自动酶标仪(美国MD公司)；TYSP-500A型高速多功能粉碎机(永康市红太阳机电有限公司)；JD2000-2G型电子天平(沈阳龙腾电子有限公司)；F-121104-7131超声波清洗机；Sorvall Legend Micro 17离心机(Thermo)。

1.2实验方法

1.2.1实验动物分组与模型建立：将60只Balb/c雄性小鼠随机分为6组，每组10只，灌胃给药，木香70%乙醇提取物低、中、高剂量组分别给予木香70%乙醇提取物125、250、375 mg/kg，乙酰唑胺组给予腹腔注射300 mg/kg乙酰唑胺，给药体积为20 ml/kg，正常对照组与缺氧模型组灌胃等体积生理盐水，连续给药5 d，末次给药60 min后将小鼠放入低压低氧动物实验舱，以2 m/s的速率减压模拟升高海拔至8000 m缺氧72 h，随后以10 m/s速度降低海拔至当地海拔高度(1517 m)，取出小鼠，水合氯醛麻醉，处死后解剖，取肝组织。

1.2.2组织线粒体重悬液制备：小鼠肝脏组织称重200 mg左右，加10倍量的分离缓冲液[6]，手动匀浆，1000×g离心2 min，吸取上清液，上清液10 000×g离心10 min，弃去上清液，沉淀加0.25 mmol/L蔗糖得线粒体重悬液。分装，-80℃储藏(测量线粒体膜电位的重悬液不可冷冻)。该过程需要在小鼠解剖2 h内完成。

1.2.3线粒体膜电位的测定:JC-10聚集在线粒体基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光，线粒体膜电位降低时，JC-10不能聚集在线粒体的基质中，此时的JC-10为单体，产生绿色荧光，所以JC-10从红色荧光到绿色荧光的转变可以容易的检测到细胞膜电位的下降。按说明书操作，使用荧光酶标仪测量，检测JC-10单体激发波长490 nm，发射波长530 nm,检测JC-10聚合物激发波长525 nm，发射波长590 nm。最后根据红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。

1.2.4线粒体顺乌头酸酶活性测定:使用荧光酶标仪测量[7]，激发波长340 nm，发射波长 466 nm，30℃ 扫描6～8 min。

1.2.5线粒体苹果酸脱氢酶活性测定:使用荧光酶标仪测量[8]，激发波长340 nm，发射波长466 nm，30℃扫描25 min。

1.2.6线粒体α-酮戊二酸脱氢酶活性的测定:使用荧光酶标仪测量[9-10]，激发波长340 nm，发射波长466 nm，30℃扫描10 min。

1.2.7线粒体呼吸链复合体Ⅰ(NADH脱氢酶)：测定方法参考文献[11]，30℃孵育5 min，600 nm连续扫描2 min。

1.2.8线粒体呼吸链复合体Ⅱ(琥珀酸脱氢酶)：测定方法参考文献[12]，30℃孵育5 min，600 nm，连续扫描2 min。

2 结果

2.1肝脏线粒体膜电位变化 与正常对照组比较，缺氧模型组线粒体膜电位显著降低(P<0.01)；与缺氧模型组比较，木香70%乙醇提取物低、中、高剂量组线粒体膜电位显著升高(P<0.01)。见图1。

图1 木香70%乙醇提取物对缺氧小鼠肝组织线粒体膜电位的影响

正常对照组与缺氧模型组灌胃等体积生理盐水，乙酰唑胺组给予腹腔注射300 mg/kg乙酰唑胺，低、中、高剂量组分别给予木香70%乙醇提取物125、250、375 mg/kg；与正常对照组比较，bP<0.01；与缺氧模型组比较，dP<0.01

2.2肝脏线粒体顺乌头酸酶活性变化 缺氧模型组线粒体顺乌头酸酶活性与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与缺氧模型组比较，木香70%乙醇提取物低、中、高剂量组线粒体顺乌头酸酶活性显著升高(P<0.05，P<0.01)，随着给药剂量的增加，线粒体顺乌头酸酶活性升高，存在一定的剂量依赖性。见图2。

图2 木香70%乙醇提取物对缺氧小鼠肝组织线粒体顺乌头酸酶活性影响

正常对照组与缺氧模型组灌胃等体积生理盐水，乙酰唑胺组给予腹腔注射300 mg/kg乙酰唑胺，低、中、高剂量组分别给予木香70%乙醇提取物125、250、375 mg/kg；与缺氧模型组比较，aP<0.05，bP<0.01

2.3肝脏线粒体苹果酸脱氢酶活性变化 缺氧模型组线粒体苹果酸脱氢酶活性与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；木香70%乙醇提取物高剂量组和乙酰唑胺组线粒体苹果酸脱氢酶活性低于缺氧模型组(P<0.05)，但木香70%乙醇提取物低、中剂量组与缺氧模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。随着给药剂量的增加，线粒体苹果酸脱氢酶活性降低，高剂量组低于低、中剂量组(P<0.05)。见图3。

图3 木香70%乙醇提取物对缺氧小鼠肝组织线粒体苹果酸脱氢酶活性影响

正常对照组与缺氧模型组灌胃等体积生理盐水，乙酰唑胺组给予腹腔注射300 mg/kg乙酰唑胺，低、中、高剂量组分别给予木香70%乙醇提取物125、250、375 mg/kg；与缺氧模型组比较，aP<0.05；与低剂量组比较，cP<0.05;与中剂量组比较，eP<0.05

2.4肝脏线粒体α-酮戊二酸脱氢酶活性变化 缺氧模型组肝脏线粒体α-酮戊二酸脱氢酶活性与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；木香70%乙醇提取物低、中、高剂量组线粒体α-酮戊二酸脱氢酶活性高于缺氧模型组(P<0.01)，随着给药剂量的增加，线粒体α-酮戊二酸脱氢酶活性升高，呈剂量依赖性。见图4。

图4 木香70%乙醇提取物对缺氧小鼠肝组织线粒体α-酮戊二酸脱氢酶活性影响

正常对照组与缺氧模型组灌胃等体积生理盐水，乙酰唑胺组给予腹腔注射300 mg/kg乙酰唑胺，低、中、高剂量组分别给予木香70%乙醇提取物125、250、375 mg/kg；与缺氧模型组比较，bP<0.01

2.5肝脏线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性变化 缺氧模型组线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性低于正常对照组，乙酰唑胺组高于缺氧模型组(P<0.01)；与缺氧模型组比较，木香70%乙醇提取物高剂量组线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性显著升高(P<0.01)，随着给药剂量的增加，线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性升高，且高剂量组高于低、中剂量组(P<0.05)。见图5。

图5 木香70%乙醇提取物对缺氧小鼠肝线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性影响

正常对照组与缺氧模型组灌胃等体积生理盐水，乙酰唑胺组给予腹腔注射300 mg/kg乙酰唑胺，低、中、高剂量组分别给予木香70%乙醇提取物125、250、375 mg/kg；与正常对照组比较，bP<0.01；与缺氧模型组比较，dP<0.01；与低剂量组比较，aP<0.05；与中剂量组比较，cP<0.05

2.6肝脏线粒体呼吸链复合体Ⅱ活性变化 与正常对照组比较，缺氧模型组线粒体呼吸链复合体Ⅱ活性显著降低(P<0.01)；与缺氧模型组比较，木香70%乙醇提取物低、中、高剂量组线粒体呼吸链复合体Ⅱ活性显著升高(P<0.05，P<0.01)。见图6。

图6 木香70%乙醇提取物对缺氧小鼠肝线粒体呼吸链复合体Ⅱ活性影响

正常对照组与缺氧模型组灌胃等体积生理盐水，乙酰唑胺组给予腹腔注射300 mg/kg乙酰唑胺，低、中、高剂量组分别给予木香70%乙醇提取物125、250、375 mg/kg；与正常对照组比较，bP<0.05；与缺氧模型组比较，aP<0.05，dP<0.01

3 讨论

线粒体与维持细胞正常功能密切相关，正常的线粒体膜电位是维持线粒体氧化磷酸化、产生三磷酸腺苷的先决条件，膜电位的稳定有利于维持细胞的正常生理功能。随着线粒体膜电位降低，造成线粒体通透性转换孔的开放，该通道的开放被认为是线粒体和细胞凋亡的原因[13]。本研究结果显示，木香70%乙醇提取物低、中、高剂量组线粒体膜电位高于缺氧模型组，提示木香70%乙醇提取物可以显著提高由于缺氧造成的小鼠肝脏线粒体膜电位。

三羧酸循环和糖酵解是提供能量的主要途径，顺乌头酸酶、α-酮戊二酸脱氢酶作为三羧酸循环的关键酶，苹果酸脱氢酶是糖酵解途径的关键酶，木香70%乙醇提取物能维持缺氧状态下顺乌头酸酶、α-酮戊二酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶的活性，同时能够维持线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ的活性。本研究结果显示，木香70%乙醇提取物低、中、高剂量组线粒体顺乌头酸酶、α-酮戊二酸脱氢酶活性和呼吸链复合体Ⅱ活性高于缺氧模型组，高剂量组线粒体苹果酸脱氢酶活性低于缺氧模型组，线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性高于缺氧模型组，提示木香70%乙醇提取物对缺氧小鼠肝脏线粒体具有保护作用。

目前国内外治疗高原病的药物主要是碳酸酐酶抑制剂或甲羟孕酮及糖皮质激素类药物[14]，但是由于其存在较大不良反应，作为预防高原病的药物并不理想。从传统中药中寻找不良反应小疗效确切的候选药物是目前抗高原缺氧防治药物研发的热点。木香为国内外常用药材，在我国始载于《神农本草经》，有行气止痛、温中和胃之功效，用于胸腹、胀痛、呕吐、腹泻、痢疾、里急后重、食积不消等症[15]。国内外对其研究主要集中在消化和生殖系统方面，该实验为国内外首次对木香的抗高原缺氧相关作用进行研究，从而为开发木香新的药用途径提供了实验基础。