miR-424对肝癌细胞增殖、细胞周期和侵袭活性的影响

吕 薇，龙 波，魏秀丽

我国是肝癌的高发国家，但是肝癌的致病机制目前仍不清楚，给其防治带来障碍，探讨肝癌的发生、发展以及转移机制一直是学者们关注的热点问题[1]。微小RNA(microRNA， miRNA)是一种长约22 nt的非编码性小片段RNA。近年来研究显示，miRNA可以参与基因转录后的调控，调节靶蛋白的表达，可以参与到肿瘤的致病过程中[2]。miR-424是miR-16家族成员，miR-16家族对细胞周期和表型都具有调控作用，临床研究发现，miR-424在结直肠癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌等一些实体肿瘤中低表达，并且在肝癌患者中miR-424也呈现低表达状态，与患者的预后密切相关[3]。本研究从细胞水平探讨miR-424对肝癌细胞增殖、细胞周期和侵袭活性的影响，以期探明miRNA-424在肝癌中的作用，为其临床防治提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 肝癌HepG2细胞购自中国典型培养物保藏中心，RMPI-1640培养基、胎牛血清购自美国GIBCO公司，青霉素和链霉素、结晶紫、碘化丙啶(PI)、胰酶购自美国Sigma公司，Trizol、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自大连Takara公司，LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司。miR-424表达质粒以及空质粒载体购自上海吉玛基因有限公司，miR-424和内参U引物由上海吉玛基因有限公司设计与合成，Transwell小室购于美国Corning公司。Step One Plus实时荧光定量PCR仪和酶标仪为美国Bio-rad公司产品，流式细胞仪为美国贝克曼库尔特公司产品。

1.2细胞培养 肝癌HepG2细胞在5% CO2、37℃条件下，培养于RMPI-1640培养基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素)，达到80%融合时胰酶消化传代。

1.3miR-424基因转染和鉴定 实验分为3组，空白对照组不做转染处理，阴性对照组转染空质粒载体，miR-424表达组转染miR-424表达质粒，取对数生长期HepG2细胞，1×105个/孔接种到6孔板，细胞贴壁后换无胎牛血清培养基，质粒转染按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书操作，转染2 h后换含胎牛血清培养基，继续培养24 h后使用荧光定量PCR法进行转染结果鉴定，胰酶消化细胞离心后加入1 ml Trizol，按照试剂盒说明书提取各组细胞总RNA，然后按照逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒说明书操作检测miR-424表达情况，PCR扩增条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，30个循环；72℃ 10 min。对照内参用2-ΔΔCt表示miR-424的相对表达水平。

1.4细胞增殖能力检测 使用平板克隆形成实验检测HepG2细胞增殖能力，取上述3组对数生长期HepG2细胞，1×104个/孔接种到培养皿，72 h后70%乙醇固定后加入0.5%结晶紫染色30 min，PBS洗涤后计算克隆形成率=克隆数/1×104×100%。

1.5细胞周期检测 使用流式细胞仪检测HepG2细胞周期的变化，取上述3组对数生长期HepG2细胞，1×105个/孔接种到6孔板，培养48 h后，胰酶消化收集细胞，4℃条件下无水乙醇固定过夜，加入10 μg/ml PI染色30 min后，上流式细胞仪检测，使用贝克曼库尔特公司研发的CXP流式分析软件分析细胞周期。

1.6细胞侵袭活性检测 使用Transwell实验检测HepG2细胞侵袭活性，取上述3组对数生长期HepG2细胞，1×105个/孔接种到Transwell小室，培养48 h后，4%甲醛固定后0.5%结晶紫染色30 min，显微镜计数每高倍镜视野(200×)下穿过Transwell小室的细胞数，计算5个视野取平均值。

2 结果

2.1miR-424转染效果分析 空白对照组、阴性对照组和miR-424表达组miR-424的2-ΔΔCt值分别为0.24±0.05、0.23±0.04和0.62±0.15，miR-424表达组2-ΔΔCt值显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.01)，空白对照和阴性对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2miR-424表达对肝癌HepG2细胞增殖的影响 空白对照组、阴性对照组和miR-424表达组克隆形成率分别为(37.42±6.12)%、(36.83±6.14)%和(12.26±2.04)%，miR-424表达组克隆形成率显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01)，空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 肝癌HepG2细胞增殖的平板克隆形成实验

2.3miR-424表达对肝癌HepG2细胞周期的影响 miR-424表达组HepG2细胞增殖主要停滞在G1期，G1期细胞比例显著高于空白对照组和阴性对照组，S期和G2期细胞比例显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)，空白对照组和阴性对照组间G1、S和G2期细胞比例比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2和表1。

图2 3组肝癌HepG2细胞周期的流式细胞仪检测结果

表1 3组肝癌HepG2细胞周期分布

注：与空白对照组比较，aP<0.05；与阴性对照组比较，cP<0.05

2.4miR-424表达对肝癌HepG2细胞侵袭能力的影响 空白对照组、阴性对照组和miR-424表达组穿过Transwell小室细胞数分别为284.35±37.46、272.83±37.33和82.46±20.13，miR-424表达组穿过Transwell小室细胞数低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01)，空白对照组和阴性对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 3组肝癌HepG2细胞侵袭实验结果(结晶紫染色×200)

3 讨论

原发性肝癌是全球男性癌症死亡的主要原因之一，其发病机制复杂，目前仍未阐明。近年来，miRNA在肝癌中的作用受到学者们的关注，并有作为分子标记物或治疗靶点的趋势[4]。miR-424在细胞周期、增殖、凋亡及存活等过程中有重要作用，刘明辉等[5]研究显示，在胃癌SGC-7901细胞中过表达miR-424，可以上调自噬相关蛋白Beclin1，诱导细胞自噬发生，抑制细胞增殖活力。Li等[6]研究显示，抑制miR-424后，可以显著促进卵巢癌的增殖和迁移能力。林琳等[7]发现miR-424可以通过上调Rspo3基因，促进人结肠癌Lovo细胞增殖。Wang等[8]研究显示，长链RNA LINC00511可以通过下调miR-424促进肝癌细胞的增殖，且与患者的预后密切相关。本研究结果显示，肝癌HepG2细胞转染miR-424，肿瘤细胞克隆形成能力得到了抑制，细胞的增殖主要阻滞在G1期，提示miR-424在肝癌中发挥抑癌作用。Shekhar等[9]报道，miR-424通过下调细胞周期素A2表达抑制骨肉瘤细胞周期增殖。

侵袭能力决定患者预后。Wu等[10]报道，miR-424在胆管癌细胞迁移和间变中发挥重要作用。本研究结果显示，肝癌HepG2细胞转染miR-424后，穿过Transwell小室细胞数低于空白对照组，提示升高miR-424后肿瘤细胞侵袭迁移能力得到抑制。

综上所述，过表达miR-424可抑制肝癌HepG2细胞增殖和侵袭能力，有望成为肝癌防治分子靶点。