基于TCGA数据库探讨胃癌组织中miR-96、BDNF表达变化和临床病理意义

任彦红，孙建红，侯世科，程 明

胃癌是全球第四常见的恶性肿瘤，也是癌症致死的第三大病因[1-3]，晚期胃癌患者的5年生存率仅为20%[4]。探究胃癌发生、发展的分子机制，寻找有效的治疗靶点对提高胃癌患者的预后尤为重要。微小RNA(MicroRNA， miRNA)是一种内源性短链RNA，miRNA表达失调与肿瘤的发生、发展有关[5]。有研究表明miR-96与胃癌的发生、浸润程度和淋巴结转移有关，但在国内却鲜有相关报道。为此本研究拟首先通过TCGA数据库探索miR-96表达水平与患者远期生存率的关系，及miR-96潜在靶基因，随后利用我院临床病理样本进行验证miR-96和其靶基因在胃癌组织、癌周组织中的表达差异，探讨其与胃癌的发生、发展及临床病理指标的关系。

1 资料与方法

1.1远期生存率比较 从包含TCGA数据网站下载胃癌患者数据集TCGA-miRNA、TCGA-RNA和TCGA-Clinical，筛选出同时包含生存时间数据信息和miR-96表达数据的患者共362例，按照miR-96表达水平由高到低排序，将排在前50%的患者181例设为高表达组，其余181例设为低表达组，并绘制2组生存曲线。

1.2相关靶基因筛选 利用Omisc软件，将TCGA-RNA数据集中包含的所有基因表达水平逐一与miR-96表达水平进行Pearson相关性检验，根据相关系数选取与miR-96表达水平相关性最高的基因。

1.3临床资料 收集2018年2月—2019年2月在我院行手术切除的胃癌组织和癌周组织80例，均经病理学确诊。术中将组织标本置入无RNA酶的冻存管中，然后立即放入液氮中，24 h后转移至-80℃冰箱保存备用。男51例，女29例；年龄36～76(59.2±7.7)岁；按分化程度分为高、中、低分化，高分化13例，中分化28例，低分化39例；参照国际抗癌联盟和美国癌症联合委员会2010年共同发布的胃癌TNM分期法，将患者分为TNM Ⅰ～Ⅱ期29例，Ⅲ～Ⅳ期51例；有淋巴结转移44例，无淋巴结转移36例；按照胃癌Luaren分型标准[6]将肿瘤分为肠型40例，弥漫型23例，混合型17例。

1.4实时荧光定量PCR(real time-quantitative polymerase chain reaction， RT-qPCR)检测组织miR-96及其靶基因的表达 采用RT-qPCR技术检测组织miR-96及其靶基因脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor， BDNF)mRNA表达。将胃癌组织和癌周组织研磨成粉末，加入Trizol试剂中提取总mRNA；使用Roche逆转录试剂盒(瑞士Roche公司)逆转录合成cDNA；在ABI Prism 7300荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司)上进行RT-qPCR反应，采用SYBR Green Master(ROX)反应体系；反应条件：95℃预变性15 min，95℃变性20 s，60℃退火1 min，共40个循环。引物序列：GAPDH，上游引物5'-CACUCAAGAUUGUCAGCAATT-3'，下游引物5'-UUGCUGACAAUCUUGAGUGAG-3'；miR-96，上游引物5'-AATGCGGGGCTAGGGCTA-3'，下游引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；BDNF，上游引物5'- GATGCTGCAAACATGTCCATGAG-3'，下游引物5'-TTTTGTCTGCCGCCGTTACC-3'。用2-ΔΔCt法计算组织miR-96和BDNF mRNA的相对表达水平。

2 结果

2.1miR-96表达差异对生存时间的影响 miR-96高表达组中位生存时间高于miR-96低表达组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2相关靶基因筛选 在11 193个mRNA中，BDNF是临床信息完整且与miR-96相关性最高的靶基因(r=-0.232，P<0.001)。

图1 miR-96高表达组和低表达组胃癌患者生存曲线

2.3胃癌和癌周组织中miR-96、BDNF mRNA表达量比较 以癌周组织mRNA表达量为基准，对胃癌组织mRNA表达量进行标准化。胃癌组织中miR-96 mRNA表达量明显低于癌周组织,BDNF mRNA表达量明显高于癌周组织(P<0.01)。见表1。

表1 胃癌和癌周组织中miR-96、BDNF mRNA表达水平比较

注：BDNF为脑源性神经营养因子；与癌周组织比较，bP<0.01

2.4胃癌组织中miR-96、BDNF mRNA表达量与临床病理指标的关系 miR-96 mRNA低表达和BDNF mRNA高表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移、TNM分期及Luaren分型有关(P<0.05，P<0.01)；而miR-96和BDNF mRNA表达与胃癌患者年龄、性别、肿瘤直径无显著关联(P>0.05)。见表2。

表2 胃癌组织中miR-96和BDNF mRNA表达量与临床病理指标的关系(例)

注：BDNF为脑源性神经营养因子

2.5胃癌组织中miR-96、BDNF mRNA表达量相关性分析 胃癌组织中miR-96和BDNF mRNA相对表达量呈显著负相关关系(r=-0.342,P=0.002)。见图2。

图2 胃癌组织中miR-96、BDNF mRNA相对表达量相关性分析

BDNF为脑源性神经营养因子

3 讨论

胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年新增胃癌病例约85万、因胃癌死亡病例约65万[7-8]。胃癌的危险因素包括幽门螺杆菌感染、不良饮食习惯、吸烟和肥胖等。然而，胃癌的发病机制仍不十分清楚[1，9]。寻找胃癌特异性分子标志物和治疗靶点对胃癌的早期诊断、预后评估和治疗具有重要意义[10-11]。

miRNA是一类长约22个核苷酸的非编码短链RNA，通过与其靶基因3'-非翻译区(3'-UTR)结合来调节基因表达，从而产生mRNA降解或翻译抑制，在细胞增殖和凋亡中发挥重要作用[12-13]。近年来，已经证实miRNA在多种人类肿瘤中异常表达，如胃癌、肺癌和膀胱癌等[14-17]。其中，miR-96在多种肿瘤中表达异常。研究表明，miR-96在肝细胞癌中表达下调，且miR-96低表达与微血管侵犯、淋巴结转移及肿瘤复发密切相关，且miR-96低表达的肝细胞癌患者总体生存率较高表达者更差[18]。Patani等[19]研究发现，miR-96在胃癌细胞系和组织样本中表达下调，miR-96 mRNA表达与患者淋巴结转移、肿瘤浸润深度和TNM分期呈负相关，表明miR-96低表达与胃癌的发生和进展密切相关；研究还指出miR-96 mRNA表达上调可以抑制胃癌细胞的增殖和侵袭。Liu等[14]研究指出胃癌组织中miR-96表达量较正常组织下调，并且miR-96可能通过靶向作用于B淋巴细胞瘤基因-2来抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，从而起到肿瘤抑制作用。胃癌Luaren分型是临床上常用的组织学分型方法，其中弥漫型较肠型更易发生侵袭转移和周围组织侵犯，预后较差[6]。本研究发现，胃癌组织中miR-96 mRNA表达量明显低于癌周组织，且miR-96低表达与肿瘤低分化、淋巴结转移、TNM分期增加及Luaren分型肠型减少关系密切，提示miR-96可能是一种抑癌基因，其表达下调会导致肿瘤的发生和恶性进展。

BDNF位于11号染色体的短臂上，是大脑中重要的神经营养因子，具有促进神经细胞生长和功能发育的作用[17]。近年来研究发现，BDNF还是一种重要的肿瘤调节因子，在多种人类肿瘤中异常上调，如乳腺癌、膀胱癌和肝细胞癌等[19-21]。Okugawa等[22]研究指出，BDNF在胃癌组织中的表达量明显高于邻近正常胃黏膜组织，且BDNF高表达与胃癌患者的血管浸润、淋巴结转移、腹膜扩散和不良预后密切相关；并指出BDNF及其受体(TrkB)通路的激活在胃癌发生、发展和恶性转归中发挥了关键作用。窦维佳等[23]研究报道，BDNF在胃癌组织中表达明显上调，与不良临床病理特征密切相关。刘天卿等[24]研究表明，TrkB和BDNF表达上调可能在肿瘤的侵袭和转移中扮演重要角色。本研究结果显示，BDNF在胃癌组织中的表达量明显高于癌周组织，且BDNF高表达与肿瘤低分化、淋巴结转移、TNM分期增加及Luaren分型肠型减少有关，提示BDNF高表达可能是胃癌发生、侵袭转移及恶性程度增加的重要因素。本研究还发现胃癌组织中miR-96和BDNF mRNA表达呈负相关关系，提示miR-96/BDNF通路可能在胃癌的发生、侵袭转移和恶性转归中发挥重要作用。

综上所述，miR-96低表达和BDNF高表达与胃癌发生、侵袭转移及恶性程度增加关系密切， miR-96可能通过靶向调控BDNF来抑制胃癌的发生、进展，miR-96和BDNF可能是胃癌早期诊断、预后评估和基因治疗的重要靶点。