血清和脑脊液中MMPs与TIMP-1在重症手足口合并脑炎患儿中的诊断意义

李 鹏 宋春兰 崔亚杰 朱 琳 李利平

1)郑州大学附属儿童医院 河南省儿童医院 郑州儿童医院，河南 郑州 450000 2)郑州市儿童急危重症医学重点实验室，河南 郑州 450000

手足口病是肠道病毒引起的儿童急性传染病，以柯萨奇病毒A16型(Cox A16)和肠道病毒71型(EV 71)较为常见，重症患者可引起脑炎、脑干脑炎以及神经源性肺水肿等致命性并发症[1-3]。诊断手足口病合并脑炎的患儿，早期评估患儿的神经损伤程度，对改善疾病转归具有积极价值，目前对手足口病合并脑炎的早期诊断缺乏相关的实验室检测指标，对血脑屏障具有调控作用的指标包括有基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9及基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1)等指标[4-5]，对于研究关于HFMD脑脊液及血液中MMP-2、MMP-9和TIMP-1浓度水平是如何变化的文献极少，因此本文对手足口病患儿血清和脑脊液中MMP-2、MMP-9和TIMP-1的分析，以期为重症手足口合并脑炎的诊断找到可靠的指标。

1 资料与方法

1．1一般资料选取2015-01—2018-03郑州儿童医院诊治的手足口病患儿100 例为研究对象进行回顾性分析，其中男54例，女46例，发病年龄6个月～4岁3个月，病程 1～3 d；所有患儿诊断均符合《手足口病诊疗指南(2018年版)》手足口病诊断标准[6]。HFMD诊断标准，普通型HFMD：双手、足、臀部、口腔出现皮疹或疱疹，伴或不伴发热等；在普通型HFMD基础上，合并神经系统受累(合并脑炎)，即为重症HFMD；符合以下条件之一者，为危重型HFMD：(1)严重脑功能障碍如出现频繁抽搐、严重意识障碍及中枢性呼吸循环衰竭等；(2)心肺功能衰竭前期(心率和呼吸增快、出冷汗、四肢末梢发凉、皮肤发花、血压升高)；(3)神经源性肺水肿、肺出血、心肺衰竭等。合并脑炎诊断标准：临床表现有意识改变(嗜睡、昏睡、谵妄、昏迷)，或者表现局部神经系统症状(如脑神经麻痹)，如果临床表现有嗜睡、昏迷，必须符合以下至少一个条件：(1)脑脊液白细胞数增多，细菌涂片阴性；(2)CT或MRI显示异常脑损伤。入组标准：新诊断为HFMD患儿；发病时间在5 d以内，肛拭子EV71病毒核酸阳性(RT-PCR检测)或血EV71病毒IgM抗体阳性(ELISA检测)；排除标准：外院转入、用药史不详的患儿；近1周应用糖皮质激素；发病前原有神经系统疾病。所有患儿根据疾病严重程度分为普通型HFMD组(n=55)、重型HFMD组(n=22)和危重型HFMD组(n=23)，其中重型及危重型HFMD组均为合并神经系统受累的患儿，统称为脑炎组。同时根据年龄和性别匹配原则，招募在我院健康体检儿童30例为健康对照组。本研究经我院伦理委员会批准(伦理批号：2019-k-007)。

1．2研究方法固定专业采集标本人员，对入院第1天用药治疗前重型及危重型HFMD患儿，留取脑脊液标本2 mL，行脑脊液常规及生化分析，统计脑脊液常规分析指标(脑脊液蛋白质、脑脊液白细胞计数)水平；抽取清晨空腹外周静脉血3 mL，离心提取上层血清；考虑蛋白质在低温保持下稳定性好，以上脑脊液及血清均在-80 ℃分装冰冻保。对于检测人员统一进行专业培训，严格按照规定规范各项操作。采用酶联免疫吸附法同期进行检测血清和脑脊液中MMP-2、MMP-9、与TIMP-1水平，严格按照由上海生物科技有限公司提供的试剂盒操作说明进行。

2 结果

2．1各组患儿基线情况比较各组患儿在年龄、性别、体质量等基线情况比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2．2各组患儿血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平比较普通型血清MMP-2、MMP-9和TIMP-1与健康对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，重型MMP-2、MMP-9和TIMP-1较健康对照组、普通型均显著增高(t值分别为-8.34、-43.90、-18.90和-8.52、-50.00、-21.10，均P<0.05)，危重型MMP-2、MMP-9和TIMP-1较健康对照组、普通型、重型均显著增高(t值分别为-11.60、-46.50、-24.20，-11.20、-51.70、-26.00和-2.84、-2.21、-5.63，均P<0.05)。见表2。

2．3重型和危重型HFMD脑脊液细胞数、蛋白质和MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平患儿入组后对22例重型和23例危重型HFMD行脑脊液检测，结果如下：危重型HFMD脑脊液细胞数与重型比较差异无统计学意义(t值为0.52，P>0.05)；危重型HFMD蛋白质、MMP-2、MMP-9、 TIMP-1浓度水平显著高于重型(t值分别为-10.35、-4.35、-5.76、-8.91，均P<0.05)。见表3。

2．4对照组、普通型及脑炎组中血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平比较脑炎组血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1浓度水平显著高于普通型(t值分别为-11.2、-62.2、-28.3，均P<0.05)和对照组(t值分别为-10.3、-52.60、-24.50，均P<0.05)；普通型血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1浓度水平与对照组相比，无显著性差异(t值分别为-1.23、-0.89、-1.34，均P>0.05)。见表4。

2．5血清脑脊液MMP-2、MMP-9、TIMP-1浓度相关性分析相关性分析显示，HFMD患儿血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1浓度水平和脑脊液MMP-2、MMP-9、TIMP-1浓度水平显著正相关，相关系数分别为(r=0.719，P=0.001；r=0.638，P=0.000；r=0.704，P=0.000)。

表1 各组患儿基线情况比较

注：“-”无相关数据

表2 各组患儿HFMD血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平比较

注：与对照组相比，aP<0.05；与普通型HFMD相比，bP<0.05；与重型HFMD相比，cP<0.05

2．6血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1浓度水平对HFMD合并脑炎诊断的诊断价值HFMD患儿外周血清MMP-2、MMP-9和TIMP-1浓度水平，对于HFMD合并脑炎的诊断预测价值和最佳截断值，进行ROC曲线下面积分析，结果ROC曲线下面积分别为0.956[95%CI(0.919、0.994)]、0.951[95%CI(0.906、0.996)]、0.887[95%CI(0.852、0.949)]，根据最高敏感度和约登指数最大原则，最佳截断点分别为103.59、96.34、108.64，相应敏感度和特异度分别为84.4%和94.5%、93.3和87.3%、88.9%和72.7%。见图1。

图1 血清MMP-2、MMP-9和TIMP-1对HFMD合并脑炎的诊断价值Figure 1 Diagnostic value of serum mmp-2，mmp-9 and timp-1 in HFMD complicated with encephalitis

表3 重型和危重型HFMD中脑脊液细胞数、蛋白质、MMP-2、MMP-9和TIMP-1水平比较

注：“-”无相关数据

组别n MMP2 MMP9 TIMP1健康对照组3065.61±15.7511.39±6.4551.31±15.85普通型5571.21±14.5312.68±6.3856.07±15.47脑炎组45135.53±18.83a,b97.37±7.22a,b151.14±18.11a,bF值240.44237.70505.66P值<0.05<0.05<0.05

注：与健康对照组相比，aP<0.05；与普通型相比，bP<0.05

3 讨论

HFMD是一种小儿常见的感染性疾病，合并神经系统并发症的重症HFMD多由EV71感染所致，EV71感染后，血管内皮受损，血液中白细胞及蛋白质可通过受损的血管内皮渗入脑脊液中，导致脑水肿及炎症发生和发展[7-11]。研究显示[12-13]，重症手足口病合并脑炎的重要危险因素包括有脑脊液中升高的白细胞计数及蛋白质含量。

EV71可通过病毒直接损伤、免疫损伤、诱导神经元凋亡等途径损伤神经系统[14-15]，与病毒对机体的直接损伤相比，病毒及毒素激活机体免疫系统所引起的间接损伤对机体影响更大[16]。病毒感染时血液中炎症细胞通过受损的血管内皮细胞进入脑组织中。脑屏障是脑组织与血液循环之间起隔离作用的屏障，由脑血管内皮细胞，周细胞及胶质蛋白等组成，有研究显示颅内感染时，血脑屏障的通透性增加[17-18]，改变其通透性的损害指标主要为MPPs、TIMP。本研究显示不同病情HFMD患儿血清和脑脊液中MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平，随着病情加重、且合并脑炎的HFMD患儿血清和脑脊液中MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平显著增高。

MPPs为金属离子依赖性蛋白水解酶，其中临床最常用的是MPP-1、MPP-2和MPP-9，其在人类不同状态时有不同作用，在人们健康状态时形成局部血管具有修复、重建等作用，在人们病理过程中对基底膜细胞具有降解、破坏等作用，并对中枢神经系统的炎症反应有激活作用[19-23]。TIMP是一种特异性高的糖蛋白，临床主要以TIMP-1为主，可抑制MPPs活性，且很少受其他细胞因子诱导、调控。其作用为[24-27]：(1)损害胶原蛋白.在病毒感染后，MMP-2、MMP-9等水平增高从而损害基底膜细胞及其胶原蛋白，导致基底膜的通透性增加，致使致病菌及炎症因子进入脑组织中造成脑细胞等损害。(2)MMPs与TIMP平衡失调。在人们健康状态时MMPs与TIMP保持于动态平衡状态，从而维持颅内毛细血管基底膜结构的紧密型，维持血脑屏障的通透性，而在病毒感染后，平衡被打破，可产生大量的炎性因子从而使细胞外基质代谢紊乱，血脑屏障通透性增加，大分子的蛋白质及致病菌侵入脑组织中，造成脑损害。本文研究相关性分析结果显示，血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平与脑脊液中MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平均呈显著正相关，提示患儿血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平高低可反映HFMD重症病例是否合并脑炎，进一步行ROC曲线显示，外周血清MMP-2、MMP-9和TIMP-1浓度水平，对于HFMD合并脑炎的诊断预测价值和最佳截断值，进行ROC曲线下面积分析，结果ROC曲线下面积分别为0.956[95%CI(0.919、0.994)]、0.951[95%CI(0.906、0.996)]、0.887[95%CI(0.852、0.949)]，根据最高敏感度和约登指数最大原则，最佳截断点分别为103.59、96.34、108.64，相应敏感度和特异度分别为84.4%和94.5%、93.3和87.3%、88.9%和72.7%，提示外周血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平对于HFMD合并脑炎具有一定诊断价值。

血清和脑脊液中MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平变化对于手足口病合并脑炎的辅助诊断在临床上具有重要的意义。为合并脑炎的重型HFMD患儿提供检测手段，且MMP-2、MMP-9、TIMP-1检测方法快速，特异，血清样本比较容易获得，具有很好的临床适用性，有助于早期治疗从而减少致残率及病死率。但本次所取样本数量偏小，且为单中心的研究，希望能有更多研究样本数量、多中心研究以期获得更可靠的结论。

利益冲突，所有作者均声明不存在利益冲突作者贡献声明：李鹏：实验操作、论文撰写、统计学分析；崔亚杰、朱琳、李利平：数据整理；宋春兰：研究指导、论文修改、经费支持