miRNA-9和miRNA-218在髓母细胞瘤中的表达及意义

曹秋影 孟伟伟 周艳华 巩姣梅 杨 萍△

郑州大学第二附属医院 1)核医学科 2) 输血科 3) 产科 4) 检验科，河南 郑州 450003

髓母细胞瘤(medulloblastoma，MB)是一种高度恶性的中枢神经系统的神经上皮性肿瘤，其发病机制复杂，多发于儿童。目前，MB治疗包括手术切除、颅脑放射、化疗和高危患者的骨髓移植，其5 a生存率为60%～70%[1-2]。 尽管治疗方法取得了进展并尝试早期检测转移细胞，但MB患者肿瘤复发的发生率约为40%，仍然有30%死于该病[3-4]。 微小RNA(miRNA)是长度为20～27个核苷酸的小的非编码RNA，其通过与同源序列结合来调节基因表达，多作用于编码的信使RNA(mRNA)的3’端非编码区，miRNA在各种细胞过程的发育、分化和代谢中发挥关键作用[5-7]。本研究通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术对MB患者组织中miRNA-9和miRNA-218的表达进行检测，探讨其在MB中的诊断价值，以期为MB的治疗和预后判断提供新的思路。

1 材料与方法

1．1研究对象选取郑州大学第二附属医院确诊原发肿瘤为MB的手术患者11例，年龄(6.60±2.00)岁，男5例，女6例。本实验样本选用癌组织为实验组，癌旁组织为对照组。样本经病理科工作人员取材，置于事先预冷的1.5 mL RNase-free的EP管内，于-80 ℃低温冰箱中长期保存。

1．2 miRNA-9和miRNA-218的提取-80 ℃的低温冰箱中迅速取出组织标本，切取组织标50 mg，置于新的EP管加入1 mL Trizol裂解液。采用组织破碎仪上充分匀浆，室温静置5 min，取上清液转入EP管中。加入200 μL氯仿，剧烈振荡15 s，室温静置5 min，4 ℃ 12 000 r/min ×15 min离心。离心后的标本吸取上清液至EP管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后室温静置5 min，4 ℃12 000 r/min×8 min离心。弃上清，加入75%乙醇充分混匀，4 ℃ 7 500 r/min×5 min离心。弃上清，待乙醇挥发后加入20 μL无RNA酶水，吹打均匀使其充分溶解，留取2 μL用于RNA质量检测，其余RNA溶液放置-80 ℃冰箱备用。

1．3 miRNA-9和miRNA-218的测定总RNA特异的茎环引物反转录按照反转录试剂盒说明书配置，以转录的cDNA为模板，按照qRT-PCR试剂盒说明书操作。miRNA-9序列：5'-GTTATCTAGCTGTATGAGTGCC-3'；miRNA-218引物序列：5'-ATGGTTCCGTCAAG-CACCATGG-3'；U6 序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'。样品做3个平行孔，取其均数。相对表达量以2-△△Ct计算[8]。△△Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组。

2 结果

2．1组织miRNA-9和miRNA-218表达和MB癌旁组织相比，miRNA-9在MB组织中相对表达量为0.44±0.40表达降低(P<0.05)，miRNA-218在MB组织中相对表达量为0.55±0.32表达下降(P<0.05)。见表1和图1。

2．2组织miRNA-9和miRNA-218表达与临床病理特征的关系miRNA-9和miRNA-218的表达肿瘤大小、淋巴结转移和组织学分级均无关，差异均无统计学意义(P≥0.05)。见表2。

项目MB组织正常组织miRNA95.29±0.963.53±1.18miRNA2186.60±0.695.51±0.82P值0.0000.000

注：＊表达量采用△Ct表示，△Ct= Ct(目的基因)-Ct(内参)

图1 miRNA-9和miRNA-218的相对表达量Figure 1 Relative expression of miRNA-9 and miRNA-218

表2 MB患者中miRNA-9和miRNA-218的表达与临床病理特征的相关性

3 讨论

脑肿瘤是继白血病之后，儿童时期第二常见的肿瘤[9]。MB是一种小脑/第四脑室的胚胎肿瘤，是儿童中最常见的恶性肿瘤之一，占所有儿童中枢神经系统(CNS)肿瘤的20%[10]。2016年，世界卫生组织更新了CNS肿瘤的分类，并在传统的组织病理学分类中引入了分子特征[11-12]。miRNAs是作为小非编码RNA，与其目标mRNA的3'端非编码区域结合，通过抑制蛋白的转译而降低蛋白质水平，进而调控胚胎发育、细胞增殖、凋亡和分化等多种生物学过程[13-14]。人类许多实体肿瘤和血液病中都发现了miRNAs的调控障碍，miRNAs已经被确定为能够引起肿瘤发展恶化或着抑制肿瘤生长[15]。越来越多的研究发现MB患者存在miRNAs表达异常，而这些失调的miRNA通过改变正常基因表达作用于某些蛋白而引发机体代谢异常，不仅在疾病的诊断，在疾病的发展过程中发挥重要作用[16-17]。

miRNA-9是一种多功能基因，其包含3个独立的基因(mir-9-1、mir-9-2和mir-9-3，分别位于1、5和15号染色体上)，根据肿瘤的类型可以作为致癌基因，也可以作为肿瘤抑制剂[18-19]。ZHU 等[20]发现miRNA-9能够抑制C-X-C趋化因子受体4(CXCR4)的表达，进而抑制急性髓细胞性白血病(AML)细胞的攻击行为，miRNA-9/CXCR 4轴可能是AML的潜在治疗靶点。miRNA-9与许多相关的神经系统疾病的发生有关，YANG等[21]发现miRNA-9可能在缺氧缺血性脑损伤期间通过对脑组织中的少突细胞系基因1进行了负调控进而发挥了作用。此外，还有研究发现miRNA-9在阿尔茨海默氏病或亨廷顿病患者中的表达也发生了明显紊乱，miRNA-9在缺氧缺血性脑损伤后的髓鞘修复中发挥了关键作用[22]。

TU等[23]研究显示，miRNA-218 能够抑制细胞侵袭，同时胃肠道间质瘤(GIST)癌细胞凋亡，根据荧光素酶报告基因测定所示，KIT1已经证实是miR-218的靶基因，通过有效转染加载miR-218的纳米颗粒，可以作为在肿瘤抑制miRNAGIST的治疗中发挥作用。不仅仅在肿瘤治疗中，在感染和炎症疾病中，miRNA也参与了机体多种免疫细胞的发育和功能调控[24]。GUO 等[25]研究发现，患有牙周炎的大鼠和人的牙周膜祖细胞中miRNA-218表达水平下降，基质金属蛋白酶-9(MMP9)水平则升高，miRNA-218通过调节MMP9对牙周炎提供了保护作用，可以减轻牙周炎大鼠的骨吸收和炎症。ZHANG等[26]发现miRNA-218在宫颈癌中与gli3和ki67蛋白的表达呈负相关，miRNA-218过度表达能显著抑制细胞增殖、凋亡和细胞周期。 此外，miRNA-218在胰腺组织中相对表达明显低于匹配的非胰腺癌组织，胰腺癌组织中的低表达与TNM分期、远处转移和肿瘤分化有很强的相关性，与胰腺癌患者总存活时间也有显著相关性，对胰腺癌的预后有很大的潜在价值[27]。

本研究表明，miRNA-9和miRNA-218在MB患者癌组织中的表达明显低于癌旁组织，差异均有统计学意义。miRNA-9和miRNA-218在MB患者癌组织中的表达与性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移和组织学分级均无关。由于研究所纳入样本量有限，不排除实验存在误差及肿瘤的大小和分期分级有关，其在MB发病中的具体作用机制还有待进一步研究。本研究证实了miRNA-9和miRNA-218在MB中的表达异常，推测其对MB的发生和发展产生作用，为其分子机制的探讨奠定了一定基础。

MB发生和发展的病理过程极其复杂，而miRNA-9和miRNA-218很大可能参与了MB的调控过程，两者有望成为新的有效靶点指导临床诊疗。