老年性痴呆患者载脂蛋白E基因多态性与淀粉样β蛋白前体16-17外显子表达的相关性及意义

刘 博 孟凡超

郑州市第二人民医院，河南 郑州 450000

老年痴呆症又称阿尔茨海默病，是发生在老年期及老年前期的一种原发性退行性脑病，是一种持续性高级神经功能活动障碍，临床症状主要表现为记忆力、思维能力、分析判断能力、视空间辨认能力、生活自理能力及情绪控制等方面的障碍。随着社会老龄化进展，AD在全球的发病率持续上升，目前是社会研究的热点，AD的病因及其发病机制仍不明确。一般认为老年痴呆症特征性病理变化为大脑皮质萎缩，脑内大量β样淀粉酶蛋白(Aβ)积聚形成的老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)是AD主要的病理特征。载脂蛋白 E是一种主要的胆固醇载体，在维持周围和大脑的脂质平衡方面起重要作用，ApoE主要由星形胶质细胞产生，并通过低密度脂蛋白受体(LDLR) 的成员传递胆固醇和其他必需的脂质，参与脂质的代谢与转运。ApoE不仅与动脉粥样硬化密切相关，且有助于神经元的修复及大脑葡萄糖的代谢，并参与神经元的分化和迁移。此外与各种病因导致老年化的认知功能受损相关，使人类智能受到严重影响。AD是由多种原因共同影响导致的，存在多源性，1、14、19及21号染色体或其他因子突变导致AD[1-3]。近年来，研究发现不同ApoE的异构体对β-App的水解作用有所差异，ApoE4表达相比ApoE3更易形成显著β-APP沉淀[4-8]。本文应用PCR-RFLP技术和RT-PCR技术测定AD患者和健康老年人的ApoE基因多态性与β-APP16-17表达相关性。

1 资料与方法

1．1一般资料以郑州市第二人民医院2018-02-2019-08诊治的32例AD患者为研究组，均经症状、认知测评、颅脑CT或MRI等检查确诊，符合《中国痴呆与认知障碍诊治指南》相关诊断标准[9-14]。临床表现为记忆力减退、语言能力退化、行为障碍等。纳入标准：(1)确诊为AD，且为首次诊治；(2)年龄60～80岁；(3)对研究知情并配合。排除心肝肾功能不全、继发性痴呆、颅脑创伤及颅脑恶性肿瘤等患者。男18例，女14例；年龄62～75(68.5±3.4)岁；病程1～5(3.2±0.8)a；文化水平：初中及以下22例，高中6例，大专及以上4例。选取同期到郑州市第二人民医院健康体检的32例健康老年自愿者为正常组，均无心脑血管病变、恶性肿瘤、颅脑创伤扥病症，对研究知情并同意。男20例，女12例；年龄59～75(64.3±3.6)岁；文化水平：初中及以下17例，高中11例，大专及以上4例。2组基线资料无显著性差异(P>0.05)，具有可比性。

1．2方法

1．2．1 检测准备：2组受检者均抽取晨起空腹外周静脉血5.0 mL，进行常规抗凝处理后，再进行DNA、RNA提取，应用紫外线分光光度计测量260 nm、280 nm波长部位的吸光度值，两者比须高于2。

1．2．2 ApoE基因检测：开展PCR-RFLP检测，选取ApoE基因第4外显子含有编码为第112位、158位氨基酸一段基因序列对其基因多态性进行分析，以F4(5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3’)和F6(5’-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3’)作为扩增引物。扩增产物长为244bp，通限制性内切酶处理完成后，根据酶切电泳图谱分型。

1．2．3 β-APP16-17检测：检测材料：①RNA反转录cDNA，20 μL反应液含4 μL总RNA，随机引物量为(0.5 g/L)1 μL，RNA sin Inhibitor为0.5 μL，dNTPs、10×Buffer各2 μL，MgCl2为4 μL，AMV反转录酶为1 μL及一定量DEP处理水。42 ℃ 90 min，52 ℃ 30 min，保存在-20 ℃环境下。②β-APP16-17表达引物，取β-APP基因16、17外显子含编码β-APP一段基因序列合成β-APP，以APP9(5’-GACAAATATCAAGACGGAGGAG-3’)、APP10(5’-CCACACCATGATGAATGGATGTG-3’)作为扩增引物，扩增产物长为233 bp。③参照模板引物，选用和VD、AD不相关且在血细胞表达的人红细胞β血影蛋白基作为参照模板。并扩增β血影蛋白基因一对引物的5’端分别与上上述引物App9、App10序列相接，引物包括BS1-App9(5’-G ACAAATATCAAGACGGAGGAGGTGGCTGAGGCGTGGCT-GATTGC-3’)、BS3-App10(5’-CCACACCATGATGAATGGATGTGTCTCAAAAGCCTCATGCCTC-3’)，通过常规PCR处理后，合成长154 bp片段，应用纯化DNA测定浓度。再稀释成100 μmol/L溶液置于-20 ℃冰箱保存。

1．2．4 检测操作：①竞争RT-PCR检测，每一份样本同时行4管PCR，每管内加等量1 μg cβ-APP与不等量gApp(10、5、1与0.5 amol)，引物主要是App9、App10，dNTPs 200 μmol/L及Taq酶与适量水，虽然反应体积是50 μL。PCR循环参数93 ℃为 30 s，60 ℃为 60 s，74 ℃ 为90 s，一共40个周期，再行74 ℃延伸。每份样本4管PCR产物于同块含EB1.5 g/L琼脂糖凝胶上点样电泳，100 V电泳1 h。每个样本管PCR可作为两条DNA扩增带，gβ-APP、cβ-APP模板产物长分别是154 bp、233 bp。②β-APP16-17检测，把每份样本电泳图输入VIDAS图像处理系统，然后对2条DNA带进行吸光度扫描，以得到吸光度值；然后再算得log cApp16-17/gApp16-17。将4个amol浓度的gβ-APP16-17值作为X轴，相应的cApp16-17/gApp16-17吸光度比值的log值作为Y轴，开展直线回归分析，以得到cApp16-17/gβ-APP16-17作为1时，其相应gβ-APP16-17 amol值即该样本测定的cβ-APP16-17表达水平[15-19]。

2 结果

2．1 2组ApoE基因型频率及等位对比2组均以ε3/ε3型为主，研究组患者的ε3/ε3型显著低于正常组(P<0.05)，ε3/ε4、ε4/ε4基因型频率增高。见表1。同时，研究组ε3等位基因频率低于正常组(P<0.05)，ε4等位基因频率高于正常组(P<0.05)。见表2。

表1 2组ApoE基因型频率比较 [n(%)]

表2 2组ApoE等位基因型频率比较 [n(%)]

2．2 2组β-APP16-17表达对比通过竞争检测，研究组患者的β-APP16-17表达水平为(3.61±0.88)pmol/g，正常组为(2.28±0.51)pmol/g，有显著性差异(t=10.253，P<0.05)。

2．3 2组不同ApoE等位基因的β-APP16-17表达对比根据ApoE等位基因分成ε2、ε3、ε4等位基因携带者，通过测定，2组不同等位基因携带者的β-APP16-17表达存在差异，但无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2．4 2组ApoE有无ε4等位基因的β-APP16-17表达对比2组ApoE有ε4与无ε4等位基因的β-APP16-17表达差异无统计学意义(P>0.5)。见表4。

表3 2组ApoE等位基因的β-APP16-17表达水平比较

表4 2组有无ApoE等位基因的β-APP16-17表达水平比较

3 讨论

3．1 ApoE基因ApoE是人体一个重要载脂蛋白，其基因在人类第19号染色体上。在编码区第4个外显子单个碱基的替换，也就是T-C互换构成ε2、ε3及ε4等三个遗传性、共显性等位基因，这三者中任何两个表达均可形成6种表型，即3种纯合子与3种杂合子，其中，ε4是临床研究最先被确定是AD易感易发基因[20-22]。

3．2 β-APP基因β-APP基因是位于人类第21号染色体上一个基因，由其第16、17外显子编码水解片段β-APP16-17，研究证实是AD患者老年斑一个主要的蛋白成分[23-24]。在β-APP正常水解代谢单单产生少量的Aβ，但在病理状态下，倘若某个因素，譬如：神经元变性，就会促进β-APP表达上调，进而改变其代谢，致Aβ水平显著增高。β-APP基因的100～207区间有着ApoE结合位点，ApoE 2、3、4均能够与β-APP的分子相结合。研究发现[25-26]，把ApoE和App751共表达于COS1细胞，会对COS1细胞的β-APP代谢分泌造成影响，造成细胞分泌型β-APP减少。

3．3 ApoE、β-APP与AD相关性临床上对AD患者的脑脊液进行成分分析，结果证实ApoE为淀粉类基因蛋白质病理性结合因素。且ε4等位基因频率在正常人群为0.15，在AD患者为0.50。神经病理学研究表明，Aβ与ApoE稳定结合，且AD个体会表现出对ApoE4的剂量依赖性增强。此外，在人的脑脊液、血浆以及脑组织匀浆中，均发现ApoE与某些可溶性Aβ会有部分联结。研究表明[27-28]，ApoE在Aβ形成中发挥着动力学抑制因子效用，具体而言，就是通过作用于Aβ的“成核”与纤维形成，进而对β-APP的β折叠产生影响，进一步对Aβ沉积造成影响。同时，ApoE还能够通过ApoE受体清除神经纤维内的Aβ。还可通过Aβ自脑细胞外进到系统循环运输清除Aβ。

本研究显示，AD患者的ε3/ε4、ε4/ε4基因型频率显著增高，且ApoEε4等位基因是AD发生的重要危险因子，但其对AD患者的β-APP16-17表达水平无明显影响。与国外研究报道的β-APP表达水平增高的结果有所出入，可能是本研究的样本量少，定量精确度不够造成的[29-30]。因而，需要进一步开展更大样本的研究分析，并研究进行有着ApoE各等位基因与β-APP基因突变AD患者的β-APP16-17表达水平检测，以便系统、全面地明确β-APP16-17过分表达的内在原因，进而为AD的诊治提供新的方向和方法指导。