黄芩药材及饮片的HPLC指纹图谱研究

安 琪，毛梦倩，孙 红，刘亮亮，陈素娥

(山西卫生健康职业学院，山西 晋中 030619)

1 引言

黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)为唇形科黄芩属多年生草本植物，《中国药典》2015版采用黄芩的干燥根作为其药用部位，性苦味寒，具有清热、燥湿、泻火等功效[1]。黄芩在山西、陕西、东北三省等地多有分布，河北、山东为道地产区[2]。黄芩主要化学成分包括黄酮类、木脂素类、糖类及挥发油等，在抗炎、抗肿瘤、抗氧化等方面有很好的药理活性[3]。

中国药典2015版采用黄芩药材经过短时蒸制或沸水煮，再切片、干燥制得黄芩饮片。因此，黄芩药材的质量和饮片加工过程极大地影响着黄芩片的临床疗效和质量稳定性。本实验选取10批黄芩药材和饮片进行指纹图谱相似度研究，为其质量控制提供依据。

2 仪器与材料

安捷伦高效液相色谱色谱仪1 100系列，黄芩苷(批号为110715-201821，纯度为97.9%)、汉黄芩苷(批号为112002-201702，纯度97.9%)、黄芩素(批号为111595-201808，纯度为97.9%)、汉黄芩素(批号为111514-201706，纯度为97.9%)，野黄芩苷对照品(批号：110842-201709；含量：91.7%)，以上对照品均由中国食品药品检定研究院提供，色谱级和分析级甲醇均采购于天津市康科德科技有限公司。

黄芩药材和饮片均由某企业提供，经山西卫生健康职业学院杨翠玲副教授鉴定为唇形科黄芩属植物黄芩的干燥根。黄芩药材和饮片批次相同，具体批次如下表：

表1 样品批次

3 方法与结果

3.1 色谱条件

通过对流动相不同类型、流速、色谱柱条件等条件进行优化，采用如下色谱条件：色谱柱：Agilent zorbax XDBC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温设定为30℃；进样体积10 μL；有机相为甲醇(A)，水相为0.1%磷酸水(B)；流速1 mL/min；检测波长为270 nm。流动相梯度洗脱程序见下表。

表2 流动相梯度洗脱程序

3.2 对照品溶液的制备

取汉黄芩苷、黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷、汉黄芩素对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成浓度分别为160 μg/mL、480 μg/mL、120 μg/mL、8 μg/mL、48 μg/mL的对照品溶液。

3.3 供试品溶液的制备

取黄芩、黄芩饮片粗粉约0.3 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加40 mL 70%甲醇，称重，超声提取半个小时，放置室温冷却，再称重补足重量，震荡混匀，吸取上清液，过滤得到供试品溶液。

3.4 精密度试验

取供试品溶液一份，按照“3.1”项下重复进样6次，对连续6次结果进行数据处理。测得各共有峰的相对保留时间RSD(%)在0.01%～0.20%之间，相对峰面积RSD(%)在0.12%～3.88%之间，符合要求。

3.5 重复性试验

取样品粉末6份，每份约0.3 g，精密称定，分别按照“3.3”项下方法制备供试品溶液，按照“3.1”项下进样分析，进行数据处理。各共有峰的相对保留时间RSD(%)在0.06%～1.29%之间，相对峰面积RSD(%)在0.96%～4.95%之间，符合要求。

3.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，考察在不同时间点(0、2、4、8、12、24 h)样品的稳定性。测得各共有峰的相对保留时间RSD(%)在0.19%～0.45%之间，相对峰面积RSD(%)在0.08%～5.00%之间，表明供试品溶液在24 h内稳定。

3.7 样品测定

取10批黄芩药材样品，按照“3.3”项下制备供试品溶液，按照“3.1”项下依次进样分析，得到17个共有峰，通过紫外吸收光谱比对和对照品加入法进行了色谱峰的归属，其中4号峰为野黄芩苷，7号峰为黄芩苷，13号峰为汉黄芩苷，16号峰为黄芩素，17号峰为汉黄芩素，共指认了5个共有峰，混合对照品和典型黄芩药材色谱图分别见图1和图2。

4-野黄芩苷;7-黄芩苷;13-汉黄芩苷;16-黄芩素;17-汉黄芩素

图2 典型黄芩药材色谱图

3.8 指纹图谱的建立

3.8.1 参比峰的选择 样品图谱显示中汉黄芩苷与相邻色谱峰分离度良好，峰位适中，峰面积稳定，所以确定汉黄芩苷为参比峰。

3.8.2 指纹图谱共有模式的建立 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012A)对10批黄芩药材及饮片进行指纹图谱分析，以S1号药材图谱作为参照谱，以平均数法生成对照指纹图谱的共有模式。选取“时间窗宽度”为0.5 min，采用中位数法计算，匹配后的10批药材和10批饮片色谱图见图3和4。

图3 10批黄芩药材HPLC指纹图谱

图4 10批黄芩饮片HPLC指纹图谱

3.9 指纹图谱相似度分析

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012A)分别对10批药材和10批饮片指纹图谱进行相似度评价，结果见表3与表4。从表3看出10批药材指纹图谱与对照图谱的相似度不低于0.991，均值在0.999，说明不同批次药材之间相似度较高。10批饮片相似度评价结果均值为0.993，相似度较高，除S1(相似度为0.966)外，其余各批次相似度均不低于0.991。说明炮制过程批间差异较小。

表3 10批黄芩药材指纹图谱相似度评价结果

表4 10批黄芩饮片指纹图谱相似度评价结果

4 讨论

本实验进行了UV全波长扫描，结果显示在270 nm波长下，特征峰响应较高，噪音低，黄酮类成分色谱峰信息全面。实验中考察了流动相pH和柱温，发现当磷酸浓度为0.1%时，各特征峰峰形较好，因此选择磷酸的浓度为0.1%。当柱温为30℃时，各个色谱峰有较好的分离度。

本实验对提取溶剂进行考察，比较了不同浓度的甲醇溶液的提取效率，结果显示当提取溶剂为70%甲醇时，提取效率最高。实验中考察了超声与回流两种提取方法的提取效率，结果表明超声提取效率要优于回流提取，且操作简便，故实验中采用超声提取方法。

黄芩中黄酮类化合物具有很强的药理活性，在抗炎、抗HIV、保护神经细胞等方面有很好的作用[4]。黄光强等[5]基于中药质量标志物概念，提出将黄芩中的黄酮及其苷类成分作为黄芩潜在质量标志物的观点，本实验通过对黄芩药材及饮片的指纹图谱的研究，指认了其中5个黄酮类成分，为后续黄芩的质量标志物研究提供参考。

5 结论

本实验研究所得的HPLC指纹图谱能够反映黄芩药材与饮片的固有特性，结合相似度分析，可以为黄芩药材与饮片的质量标准提升提供参考。