主养草鱼池塘中氨氧化古菌的多样性和种群分布

刘承情，代梨梨，宋超峰，彭 亮，李晓莉，陶 玲，李 谷

(1.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉430223；2.上海海洋大学海洋科学学院，上海201306)

微生物驱动的氮循环在氮的生物地球化学循环中发挥着重要作用，其中主要由氨氧化微生物参与的氨氧化过程是硝化作用过程中的第一步，也是限速步骤[1]，受到各界学者的广泛关注。而21世纪以来，古菌氨单加氧酶α亚基(Ammonia monooxygenase α-subunit，amoA)基因的发现[2]和氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea，AOA)NitrosopumilusmaritimusSCM1的分离培养[3]，使得对氨氧化微生物的研究从细菌域扩展到古菌域。Pester等[4]把AOA分为五类，分别是Nitrosopumiluscluster(group I.1a)，Nitrosotaleacluster(group I.1a-associated)，Nitrososphaeracluster(group I.1b)，Nitrososphaerasister cluster，和Nitrosocalduscluster(ThAOA)，其中Nitrososphaerasister cluster类群中还未有AOA被分离。

目前AOA在养殖环境中的研究还非常有限，且多集中于海水和循环水养殖。例如三疣梭子蟹养殖塘中的研究表明水体中的AOA多属于Nitrosopumiluscluster[5]；南美白对虾养殖池塘沉积物中的研究则表明AOA群落结构比较单一，且大多属于泉古菌门(Crenarchaeote)[6]；在淡水循环水养殖系统中进行的研究表明AOA的多样性和丰度都高于氨氧化细菌(AOB)，且认为AOA在其中起着主要作用[7]。池塘养殖作为我国最主要的淡水养殖方式，通过研究养殖池塘环境中的氨氧化微生物，特别是氨氧化古菌，对于养殖过程中因配合饲料的大量使用而导致的有害氮素的去除具有重要意义，且能够丰富当前氨氧化微生物的研究内容。因此在本研究中，我们以我国重要的淡水养殖区-湖北荆州地区的风生水起生态农场的主养草鱼池塘为研究对象，通过amoA基因研究了淡水养殖池塘沉积物和水体中氨氧化古菌的多样性和种群分布，以期为淡水养殖池塘的氮素调控提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

风生水起生态农场位于湖北省荆州市荆州区，养殖水域由长江故道改造而来，长1 200 m，宽90 m，总面积为108 000 m2，平均水深为4～5 m，底泥深度约为1 m，故道的两端已通过筑坝与外界水体隔离开来。池塘中主养草鱼，套养花白鲢和团头鲂。在该养殖池塘中通过围隔分为3个养殖区域(分别标记为F1、F2、F3)。养殖早期(2017年5月25日)在每个养殖区域设置3个采样点(呈等边三角)，使用彼得逊采泥器采集沉积物，均匀混合后装入灭菌的封口聚乙烯袋，使用有机玻璃采水器采集水样，混匀后装入500 mL聚乙烯瓶中。样品采集完成后立即低温运回实验室，水样用滤膜过滤储存于-20 ℃，沉积物样品分装后部分风干并过筛，储存于4 ℃或-20 ℃以用于后续分析。采样区域沉积物和水体理化指标见表1。

表1 沉积物和水体的理化性质Tab.1 Physical and chemical properties of sediment and water

1.1.2 主要试剂和仪器

E.Z.N.A.TMWater DNA Kit试剂盒(Omega)，DNeasy®PowerSoil®Kit试剂盒(QIAGEN)、2×Utaq MasterMix(庄盟生物)、10×DreamTaq buffer、DreamTaq DNA Polymerase、2mM dNTP Mix(均购自Thermo)、PCR仪(LifeECO)、凝胶成像仪(BIO-RAD)、电泳仪(DYY-6C型)。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取

采用E.Z.N.A.TMWater DNA Kit试剂盒提取养殖水体中的DNA，采用DNeasy®PowerSoil®Kit试剂盒提取养殖池塘沉积物中DNA，提取方法基于试剂盒说明方法，考虑到沉积物沉积物的含水率以及所提DNA的浓度，实际操作是加入0.6～1.1 g新鲜土壤，其余按说明书进行DNA的提取。

1.2.2amoA基因扩增

通过PCR扩增AOAamoA基因，所用的引物为Arch-amoAF/Arch-amoAR，其序列分别是5′-STAATGGTCTGGCTTAGACG-3′、5′-GCGGCCATCCATCTGTATGT-3′，沉积物扩增的体系为25 μL(2.5 μL 10×DreamTaq buffer、10 μmol/L引物各1.5 μL、2 mmol/L dNTP Mix 0.5 μL和样品DNA 1 μL，补ddH2O至25 μL)，扩增的条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，32个循环；72 ℃ 10 min。水体扩增的体系25 μL(包括2×Utaq MasterMix 12.5 μL，10 μmol/L引物各1.5 μL和样品DNA 1 μL，补ddH2O至25 μL)，扩增的条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 70 s，32个循环；80 ℃ 20 s。

1.2.3 PCR产物的纯化和克隆测序

使用SK8131胶回收试剂盒纯化PCR产物，纯化后PCR产物通过连接试剂盒连接到pUCm-T Vector，将连接好的载体转化入高效大肠杆菌感受态细胞。在涂有X-gal和IPTG的氨苄青霉素的LB平板上进行蓝白斑筛选，随机挑取克隆子至含氨苄青霉素的液体培养基，37 ℃培养过夜。使用SK8191 UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒提取质粒，并测序(交由上海生工生物工程股份有限公司完成)。

1.2.4 克隆测序数据分析

用公式C=1-n/N

其中C为覆盖率，即coverage，n为文库中只出现1次的克隆数量，N为该文库克隆总数用于计算文库的覆盖率。用Mothur 软件分析克隆文库的稀释性曲线；并分析计算各文库AOAamoA基因多样性参数和Shannon指数。

1.2.5 系统发育树构建

利用Mothur软件分析克隆序列，并在3%差异度水平上定义为分类操作单元(即Operational taxonomic unit，简称为OTU)。并结合NCBI网络数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的BLAST分析找到相似度最高的同源序列作为参照序列。将代表性OTU序列与相似序列一起用于系统进化树分析。使用MEGA 7.0.26，以邻接法(Neighbor-Joining)迭代运算1 000次构建系统发育树。

2 结果

2.1 AOA amoA基因的稀释性曲线和物种多样性

各采样点AOAamoA基因克隆文库的稀释性曲线如图1所示。通过计算发现各点的amoA基因在克隆文库中相对应的覆盖率均在88%以上(表2)，并且可以看出各点的曲线在后期均趋向平坦，说明本研究中克隆取样的数量合理，能够比较好的反映环境中的多样性。

图1 AOA amoA基因克隆文库稀释曲线Fig.1 Rarefaction curves for AOA amoA gene clonesS-表示沉积物样品，W-表示水体样品，F1、F2、F3为3个采样点

基于序列相似性大于97%计算的AOA OTU数目和多样性指数见表2。可以看出，F1沉积物中AOA OTU的数目要少于F2和F3，但其水体中的OTU数目却要高于后两者。F1沉积物中的AOA多样性指数也要低于F2和F3，但其水体中的多样性指数要高于后两者。说明沉积物和水体中AOA的分布存在差异，并非表现出均一性，即并非沉积物中AOA OTU数目多，其对应水体中OTU数目就多。通过对三个样点总体的比较则发现，沉积物AOA的多样性要高于水体中(OTU数目均值分别为10.33和7.33)，并且沉积物中AOA的多样性也要高于水体中(Shannon指数均值分别为1.57和1.38，Simpson指数均值分别为0.28和0.33)。

2.2 AOA amoA基因的分布

基于Mothur对沉积物和水体中各点的AOAamoA基因文库进行聚类分析，结果见图2，从图中可以看出，沉积物和水体样品分别聚为两支，且不论是在沉积物还是在水体中，F2和F3中的AOA都更为相似，这也与OTU数目和多样性的结果一致。

表2 AOA amoA基因克隆文库多样性Tab.2 AOA diversity index in amoA gene clone library

基于3%的序列差异度分析发现，沉积物和水体中共检测到24个OTU，其中沉积物中有18个OTU，水体中有13个OTU。沉积物和水体中共有的OTU包括OTU01、OTU02、OTU05、OTU07、OTU11、OTU13、OTU16，而OTU03、OTU04、OTU18、OTU19、OTU20、OTU21仅存在于水体中，其他序列OTU06、OTU08、OTU09、OTU10、OTU12、OTU14、OTU15、OTU17、OTU22、OTU23、OTU24仅存在于沉积物中，并且OTU01、OTU02在所有样点的沉积物和水体中均有检测到，这说明OTU01、OTU02是养殖池塘中的优势类群，分别占克隆子的47.38%和21.84%。

图2 沉积物和水体中AOA amoA 基因文库聚类分析图Fig.2 Clustering diagram analysis of the different AOA amoA gene clone libraries in sediment and water

进一步通过venn图分别比较了各样点沉积物和水体中AOAamoA基因文库中OTU的分布情况，见图3。在沉积物中(图3左)，F1独有的OTU是OTU13、OTU14、OTU16，F2独有的OTU是OTU17、OTU22，F3独有的OTU是OTU11、OTU15、OTU23、OTU24；而F1和F2所共有的OTU有6个，分布是OTU01、OTU02、OTU05、OTU08，OTU10和OTU12，F1和F3所共有的OTU仅有4个，分别是OTU01、OTU02、OTU05、OTU08；F2和F3所共有的7个OTU分别是OTU01、OTU02、OTU05、OTU06、OTU7、OTU08、OTU09。在水体中(图3右)，三个样点中F1所独有的5个OTU是：OTU05、OTU07、OTU13、OTU18、OTU20；OTU16是F2所独有的OTU；OTU19、OTU21是F3所独有的OTU。而F1和F2、F2和F3共有的OTU都有4个，F1、F2、F3共有的OTU也是4个，分别是OTU01、OTU02、OTU03和OTU04，此外F1和F3还共有一个OTU是OTU11。

图3 沉积物和水体中AOA amoA 基因文库OTU分布韦恩图Fig.3 Venn diagram of the different AOA amoA gene clone libraries in sediment and water左：沉积物；右：水体。图中数字表示OTU数目。

2.3 AOA amoA 基因系统发育分布

以邻接法(Neighbor-Joining)对沉积物和水体中的AOAamoA基因的OTU序列构建系统发育树，见图4。在图中可见，AOAamoA基因的OTU序列主要属于Nitrososphaerasister group、Nitrososphaeracluster、Nitrosopumiluscluster，而未检测到Nitrosocaldus cluster 和Nitrosotalea cluster。其中隶属Nitrososphaerasister group的OTU有：OTU01、OTU02、OTU03、OTU04、OTU05、OTU08、OTU09、OTU10、OTU11、OTU13、OTU16、OTU17、OTU18、OTU19、OTU21、OTU24；隶属Nitrososphaeracluster的OTU有：OTU12、OTU14、OTU15、OTU20；隶属Nitrosopumiluscluster的OTU有：OTU06、OTU07、OTU22、OTU23。

与沉积物和水体中AOAamoA基因的分布的比较发现，沉积物和水体的共有序列除OTU07外，均属于Nitrososphaerasister group。水体中除OTU07和OTU20外，均属于Nitrososphaerasister group。而沉积物中则包含检测到的Nitrososphaerasister group、Nitrososphaeracluster、Nitrosopumiluscluster中的大多数种类。各样点沉积物和水体中AOA系统类群的组成情况见图5，可以发现各样点间的AOA组成存在一定差异，但从总体上来看，水体中的AOA比较单一，几乎都为Nitrososphaerasister类群，而沉积物中Nitrososphaerasister类群虽然也占据绝对优势，但也包含相对较多的其他类群。

3 讨论

已有研究表明AOA相比AOB更适合厌氧环境[8]，且在水体[9]和土壤[10]等环境中AOAamoA基因的丰度和多样性都更为丰富。近年来已有相关研究证实了在养殖池塘中存在AOA，其中多数研究都能在沉积物中检测到AOAamoA基因，而部分研究则未能在水体中检测到AOA，这可能是受到光抑制的影响。在本研究中，我们基于amoA基因的克隆文库技术，对主养草鱼池塘中的AOA进行了分析，发现在养殖池塘的沉积物和水体中均存在AOA，但二者中的分布存在着差异。

在早期的研究中，已发现随着养殖过程的推进，池塘水体中的氨氧化微生物数量会下降，甚至难以检测到氨氧化古菌[11]。在本研究中，通过对养殖前期的分析发现，不同养殖水体中均检测到AOA的存在，说明养殖过程可能会对池塘水体中的氨氧化古菌造成不利的影响。另外，对不同养殖区域沉积物和水体的比较发现，池塘沉积物中的AOA无论是种类数还是多样性都要高于水体，而且高于在其他环境中检测到的AOA OTU数目[12]，说明养殖池塘沉积物中可能存在更为丰富的AOA种类。在养殖池塘的区域分布上，我们对不同样点的比较发现，F1沉积物中的AOA种类数和多样性都要低于F2和F3，但F1水体中的种类数和多样性要高于F2和F3，说明养殖池塘沉积物和水体中的AOA存在着差异，AOA在二者中可能分别具有相对独立的生态位。目前还没有比较养殖环境中AOA在沉积物和水体中的分布规律，这可能有待进一步研究。我们对沉积物和水体中OTU的进一步分析发现，沉积物和水体中除存在少量的共有OTU外，还分别具有各自独立存在的OTU，但检测到的OTU共有序列数量在总体上占据绝大优势，说明养殖环境中具有广分布生态位的种类可能更具优势，但这还需要进一步的研究。

图4 基于amoA基因构建的养殖池塘沉积物和水体中氨氧化古菌系统发育树Fig.4 Phylogenetic analysis of archaeal amoA gene sequences retrieved from the aquaculture ponds of sediment and water

图5 沉积物和水体中AOA系统类群的组成图Fig.5 Composition of AOA species in sediment and water

从系统发育分析结果来看，养殖池塘系统中的AOAamoA基因序列与来自土壤、沉积物、水体及部分污水处理系统的基因序列高度相似。本研究测得的AOA包括Nitrososphaerasister group、Nitrososphaeracluster、Nitrosopumiluscluster类群。先前有研究表明在养殖池塘表层沉积物中的AOA主要属于Nitrososphaera类群，而在较深层的沉积物中的AOA主要属于Nitrosopumilus类群[11]，另外针对养殖池塘水体中的研究也证明AOA绝大多数属于Nitrosopumilus类群[5]。这与本研究中的结果存在着一定的差异，本研究中测得的74%的OTU序列都属于Nitrososphaerasister group，水体和沉积物共有的OTU除OTU07属于Nitrosopumiluscluster外，其它序列均属于Nitrososphaerasister类群；而沉积物中除包含少量的Nitrososphaera类群外，主要的OTU仍然为Nitrososphaerasister类群，这说明Nitrososphaerasister类群可能是该主养草鱼池塘中最重要的氨氧化功能类群。Nitrososphaerasister类群由Pester等[4]首次提出，与Nitrososphaera类群有共同的祖先，但与AOA其他类群分离开来。虽然目前已发现Nitrososphaerasister类群在陆地环境中分布广泛且数量丰富[12]，但关于该类群的了解还很少，甚至还存在一定的争议。例如，有证据表明amoA相关的Thaumarchaeota为异养型或兼养型，因为它们在加入有机物质时生长会加快[13]。而在其他的研究中，却发现该类群的富集物能够在自养条件下生长[14]。另外在湖泊沉积物中也发现Nitrososphaerasister类群Thaumarchaeota能够固定二氧化碳[15]。虽然在本研究中草鱼池塘沉积物和水体中的高有机质和氨氮水平可能有利于Nitrososphaerasister类群的发展，但其群落动态和影响因素还有待进一步研究。

4 结论

综上所述，在主养草鱼养殖池塘的水体和沉积物中均存在较为丰富的AOA，且在水体和沉积物中的分布存在差异。AOA在养殖池塘不同区域中的分布也存在差异。AOA主要属于Nitrososphaerasister group、Nitrososphaeracluster、Nitrosopumiluscluster，但Nitrososphaerasister group是优势种群，占了AOA种群的绝大部分。