热休克诱导马苏大麻哈鱼三倍体的初步研究

魏 凯，郑 伟，时 晓，何亚鹏，韩姝伊，董 颖，陈春山

(1.北京市水生野生动植物救护中心，北京102100；2.吉林省延边自治州水产站，吉林延吉 133001；3.中国科学院动物研究所，北京 100101；4.河北师范大学，石家庄 050024；5.北京市水产科学研究所，北京 100068)

马苏大麻哈鱼(Oncorhynchusmasou)，隶属于鲑科大麻哈鱼属，是仅分布在北太平洋亚洲一侧水域的溯河洄游性鱼类，主要分布在日本和我国的图们江、绥芬河、台湾的大甲溪中[1-2]。幼鱼在淡水生活期间，分化成降海型和陆封型两个生态群体，后者终生生活在淡水河流中，不营降海洄游，但参与洄游群体的繁殖[3-5]。日本60年代将陆封型种群开发成人工养殖品种称作山女鳟，被誉为20多种鲑科鱼类中，肉质最好、最受欢迎淡水游钓鱼类，1996年引进我国后进行了详细研究[6-10]。马苏大麻哈鱼由于个体小，在原产地人工养殖2年一般体重250 g左右，而且具有鲑科鱼类繁殖后亲鱼绝大部分死亡的特征，影响规模化生产的推广。

鱼类染色体组操作是水产领域运用较为成熟的遗传育种技术之一。三倍体鱼类，理论上可以避免性腺发育阶段和产卵季节鱼肉质量下降、生长停滞和亲鱼死亡率上升等问题，并且具有个体大、生长快和成活率高等优良品质[11-12]，已成为国内外水产领域的研究热点。鲑科鱼类中的三倍体技术在虹鳟(O.mykiss)[13-14]、金鳟(O.mykissWalbaum)[15]、大西洋鲑(Salmosalar)[16]、美洲红点鲑(Salvelinusfontinalis)[17-18]、细鳞鲑(Brachymystaxlenok)[19]等鱼类中得到广泛的研究应用。但是，国内外对于马苏大麻哈鱼的三倍体研究仍处于空白状态，本研究采用热休克法进行了三倍体诱导实验，对影响诱导率的水温、受精时间和持续时间进行探讨，从而确定最佳的诱导条件。此外，考虑到部分鲑科鱼类的三倍体雄性后代同样出现性腺发育情况[13]，今后还将重点对马苏大麻哈鱼三倍体的性腺发育和全雌三倍体制备技术进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验用鱼和养殖管理

实验用鱼为吉林珲春细鳞鱼良种场培育的2+龄陆封型马苏大麻哈鱼(见图1)，体质量♀(654±182)g，♂(488±85)g。其中，雌性亲鱼524尾，共采卵60.84万粒，采卵水温8.3 ℃，孵化期水温6.4～10.8 ℃。亲鱼选择、采卵受精、孵化方法按照陈春山等[9]方法进行。马苏大麻哈鱼的三倍体诱导实验和孵化工作在珲春细鳞鱼良种场养殖车间进行，后期将部分鱼苗运至北京市水生野生动植物救护中心养殖基地进行饲养管理。每个玻璃钢水槽放置1 000尾鱼苗，养殖用水为曝气后的地下水，平均溶氧>8 mg/L，每天投喂6次，日投喂量按体重的5%～7%计算，每天上午9点和下午3点各吸污一次，养殖180 d后进行倍性检测。

图1 陆封型马苏大麻哈鱼Fig.1 Landlocked group of O.masou

1.2 三倍体诱导

实验共分13个实验组和1个对照组，实验组设4个诱导温度(24、26、28、30 ℃)，2个起始诱导时间(15、20 min)，2个持续诱导时间(15、20 min)，每组设3个重复，实验参数见表1。热休克处理在不锈钢水槽中进行，电子控温，水温误差<0.5 ℃，灵敏度0.1 ℃，热处理前用CEM高精度数字温度计(型号为DT-613)矫正水温。热处理后受精卵即刻放入装有与采卵水温相同水的容器中，静置2 h挑除死卵。对照组受精后放入相同条件容器中，与热处理卵同时挑除死卵。捡卵后放入相同孵化器中孵化。

表1 热休克诱导马苏大麻哈鱼三倍体实验参数Tab.1 Experiment parameters of heat shock induced triploid of O.masou

1.3 倍性检测

采用Pacfec CyFIow Cube 8型流式细胞仪检测鱼苗血液DNA相对含量，取两次平均值计算三倍体率。鱼苗培育至体长(8.24±0.74)cm，实验组每组随机抽样30尾，尾静脉采血，每次取3尾二倍体鱼苗作为对照，检测实验在北京市水产研究所完成。综合评分按照Gervai[20]标准，孵化率占60%，三倍体率占40%，计算综合诱导效果。

1.4 数据处理

用重量法计算采卵量。受精卵热处理后2 h挑除死卵，统计死亡率。发眼后检出未发眼卵，统计发眼率。出苗后检出未孵化卵，统计孵化率。根据抽样检测结果计算三倍体率。

实验数据采用Excel软件进行整理，用SPSS19.0进行非参数检验，分析各组间的差异性，其中P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 诱导时间对实验结果的影响

受精后15 min和20 min，热休克处理15 min和20 min都可诱导出三倍体鱼，但受精卵2 h死亡率、发眼率、孵化率、三倍体率差异显著。起始处理时间15 min的6个组间及起始处理时间20 min的7个组间上述4项指标差异较大。起始处理时间15 min和20 min之间无明显规律。持续诱导时间15 min的6个组和20 min的7个组对上述4项指标的影响与起始处理时间规律相同。说明在本实验条件下，起始处理时间和持续处理时间不是影响实验结果的主要因素。诱导结果如表2所示。

表2 马苏大麻哈鱼三倍体诱导结果Tab.2 Experiment results of triploid induction by heat shock

注：同列中不同上标字母表示各组间差异显著(P<0.05)

在受精后15 min，用26 ℃和28 ℃处理，持续处理20 min组的2h死亡率低于15 min组，而孵化率和三倍体率高于15 ℃组。30 ℃处理组恰恰相反，持续处理20 min组的2 h死亡率高于15 min组，而孵化率和三倍体率则低于15 ℃组。在受精后20 min，用26、28 ℃和30 ℃处理，持续处理20 min组的2 h死亡率高于15 min组(第4组除外)，同时也高于起始时间15 min处理20 min组；而孵化率、三倍体率低于15 ℃组和起始15 min处理20 min组。说明随着起始时间和持续时间的延长，受精卵成活率降低，特别是高温组。起始时间和持续时间都不应该超过20 min。

2.2 诱导温度对实验结果的影响

受精卵经24、26、28、30 ℃处理均获得了三倍体鱼(见表2)。各实验组2 h死亡率差异较大，都高于对照组。最高的是1组(24℃)8.01%，其次是4组(26℃)7.21%，其余各组在0.14%～2.96%之间。温度对发眼率影响较小，除第6组和13组发眼率接近50%外，其它各组都在80%左右，与对照组(83.45%)接近，最高为93.84%(2组)。温度对孵化率影响较大，实验组孵化率最高的是24 ℃组(68.35%)，最低的是30 ℃组(1.95%)。30 ℃组平均孵化率只有6.8%，26 ℃和28 ℃组孵化率也只有50%(34.02%～60.92%)左右，明显低于对照组(86.62%)，说明热休克处理对马苏大麻哈鱼受精卵的成活影响较大。温度对三倍体率的影响规律是：随着温度的升高，三倍体率逐渐升高，最低的是24 ℃组13.3%，最高的是30 ℃组90.91%。诱导温度是影响马苏大麻哈鱼三倍体诱导成功的关键因素。

2.3 三倍体诱导率

经流式细胞仪检测结果，马苏大麻哈鱼二倍体DNA相对含量为33，三倍体DNA相对含量为51(见图2)。经抽样检测,各实验组三倍体率有一定差异，最高的是12组(30 ℃)90.91%，最低的是1组(24 ℃)13.3%。平均三倍体率：24 ℃组13.3%，26 ℃组31.65%，28 ℃组52.28%，30 ℃组78.81%。

3 讨论

3.1 诱导时间的确定

人工三倍体的诱导是通过保留受精卵第二极体来实现的。精子进入卵子时，卵子正进入减数分裂中期，数分钟后即释放出第二极体。通过物理或化学的方法抑制第二极体排放，受精卵中保留了两套雌核的染色体和一套雄核的染色体而成为三倍体。因此，起始诱导时间非常重要，处理过早第二极体没有形成，外界刺激容易对卵子造成伤害。处理过晚第二极体已经释放完成，不能形成三倍体胚胎。此外，不同鱼类第二极体排放时间不同，温水鱼类较早，冷水鱼类较迟，鲑科鱼类一般在15-40 min。张燕萍等[14]认为，虹鳟授精后15 min是热休克敏感期，此时第二极体已形成但未排出细胞外，是获得三倍体的最佳时期。本实验在温度相同(26 ℃和28 ℃)的条件下，起始诱导时间15 min持续处理20 min的2 h死亡率、孵化率、三倍体率均高于起始诱导时间20 min持续处理20 min。说明马苏大麻哈鱼受精后15 min已进入减数分裂晚期，35 min后第二极体已释放完毕，此时段是获得三倍体的最佳时期。

图2 二倍体和三倍体马苏大麻哈鱼DNA相对含量Fig.2 Relative DNA content of diploid and triploid O.masou

楼允东[11]认为，温度休克诱导三倍体技术中，随着持续时间的增加(在一定处理时间范围内)，诱导率也在增加。本实验2个温度组(26、28 ℃)受精后15 min进行诱导处理，三倍体率持续诱导20 min组均高于持续诱导15 min组，30 ℃组没有差异。说明在26～28 ℃处理条件下，受精后30-35 min仍有一部分受精卵处在第二极体排放阶段，因此持续诱导时间应达到20 min。

3.2 诱导温度的确定

宋立民等[21-22]认为，三倍体诱导需要适度的外界刺激，刺激太小不能有效阻止第二极体排放，刺激过大，胚胎受到伤害，存活率降低。张艳萍等[14]采用三个不同温度(26.5、28、30 ℃)均可诱导出虹鳟三倍体，26.5 ℃效果最佳，30 ℃持续处理超过10 min受精卵全部死亡或停止发育。陈春山等[18]采用热休克法诱导细鳞鲑三倍体，受精卵2～4 h死亡率和孵化率28 ℃明显高于26 ℃。本实验处理温度30 ℃组尽管三倍体率最高，但孵化率只有1.95%～12.46%，明显低于其它各组，说明30 ℃是诱导的极限温度。

3.3 最佳诱导条件

王炳谦等[13]采用热休克法诱导全雌虹鳟三倍体，26 ℃效果好于24 ℃和28 ℃的，最佳条件为卵子受精后20 min，26 ℃处理20 min。张艳萍等[14]热休克诱导虹鳟三倍体最佳条件是受精后15 min，26.5 ℃处理10 min。Peter等[16]认为溪鳟受精卵受精10 min后，在11～12 ℃水中预处理后放入28 ℃水刺激10 min，获得三倍体率达到98%以上。Duba等[18]美洲红点鲑三倍体最佳诱导条件是：受精卵受精后15 min，用28 ℃水刺激10 min或20 min，获得三倍体率分别为53%和56%。按照Gervai等[20]评分标准，本实验条件下，马苏大麻哈鱼三倍体诱导的最佳条件是：水温28 ℃，卵子受精后15 min持续处理20 min，评分结果为57.79%。最佳诱导温度与虹鳟[13-14]、金鳟[15]、细鳞鲑[19]不同，与大西洋鲑[17]、美洲红点鲑[18]相同。处理时间与其它鲑科鱼类接近。鱼类温度休克敏感性的差异，不仅与物种遗传背景有关，还与卵子质量、亲鱼成熟度有关。本实验三倍体率较低，是否与部分亲鱼个体较小卵子成熟度差异有关还有待进一步研究。综合评分结果如表3所示。

表3 综合评分结果Tab.3 Comprehensive scoring results