HPLC法测定没食子药渣生物炭中没食子酸和鞣花酸残留量

谢 芳，李柯翱，赵 璐，田树革*

(1.新疆环境保护科学研究院,新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆奇沐医药研究院，新疆 乌鲁木齐 830013；3.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011)

没食子为蜂科昆虫没食子蜂的幼虫寄生在没食子树幼枝上形成的虫瘿，其化学成分主要是没食子酸、鞣花酸和没食子酸甲酯，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤和抑菌等作用[1]。没食子酸是一种酚酸类物质，广泛应用于农业、矿产和石油等领域；鞣花酸是一种多酚二内酯，为天然多酚，广泛存在于坚果、软果中。

目前已有文献[2]报道没食子药渣中没食子酸和鞣花酸的含量测定，但对厌氧条件下没食子药渣生物炭中没食子酸和鞣花酸残留量的测定无报道。为此，作者采用高效液相色谱法[3-6]测定厌氧条件下没食子药渣生物炭中没食子酸和鞣花酸的残留量，并考察热解温度对测定结果的影响，为没食子药渣的综合利用提供依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

没食子药渣，由新疆奇沐医药研究院有限公司提供。

没食子酸，成都科龙化工试剂厂；鞣花酸，苏州天可贸易有限公司；甲醇，天津富宇精细化工有限公司；磷酸，上海联合化工厂。

Agilent 1200型高效液相色谱仪、Agilent Diamonsil C18色谱柱，美国安捷伦公司；XS-105型十万分之一电子天平，德国梅特勒-托利多仪器有限公司；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；HH-S4型数显恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂。

1.2 没食子药渣生物炭的制备

采用限氧热解法制备没食子药渣生物炭。将没食子药渣通风晒干，粉碎，用200目筛进行细分；用电子天平准确称取没食子药渣粉末，放入磁舟中，置于高温烧结炉石英热解管的中间，用不锈钢法兰密封；在不同的热解温度(200 ℃、300 ℃、400 ℃、500 ℃、600 ℃)下热解2 h(保持厌氧条件下高温烧结炉的升温速率为10 ℃·min-1)；冷却后取出，即得没食子药渣生物炭；研磨过筛后密封，置于真空干燥箱中，即得没食子药渣生物炭粉末。

1.3 溶液的制备

1.3.1 对照溶液的制备

准确称取15.60 mg没食子酸对照品，置于10 mL容量瓶中，用甲醇[7]定容，摇匀，即得浓度为1.560 mg·mL-1的没食子酸对照母液。精密称取0.8 mg鞣花酸对照品，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，即得浓度为0.080 mg·mL-1的鞣花酸对照母液。

1.3.2 样品溶液的制备

准确称取没食子药渣生物炭粉末1.0 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，用甲醇定容；超声(功率80 W)20 min，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得样品溶液。其中400 ℃、500 ℃下热解得到的没食子药渣生物炭由于含量低，在经滤膜过滤后，需将滤液置于蒸发皿中蒸干，残渣经甲醇溶解后定容至5 mL容量瓶中，摇匀，再用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

1.4 色谱条件

Agilent 1200型高效液相色谱仪，DAD检测器，Agilent Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相为甲醇(A)-0.05%磷酸水溶液(B)，流速1 mL·min-1，进样量2 μL，检测波长258 nm。梯度洗脱：0～10 min，5%～15%A；10～26 min，15%～30%A；26～36 min，30%～50%A；36～45 min，50%～83%A。没食子酸的理论塔板数约为16 000，不低于7 000。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的确定

文献报道，没食子酸在216 nm、269 nm处有较强吸收峰[8]，鞣花酸在258 nm、366 nm处有较强吸收峰[9]。通过测定对照溶液和样品溶液在190～800 nm范围内的HPLC图谱，选择258 nm作为检测波长。

2.2 HPLC图谱

混合对照溶液和样品溶液的HPLC图谱如图1所示。

由图1可知，在相同色谱条件下，对照溶液和样品溶液的保留时间一致，样品分离度较好。表明没食子药渣生物炭中主要含没食子酸和鞣花酸。

2.3 线性关系考察

准确吸取没食子酸对照母液2.24 mL，置于10 mL容量瓶中，定容，分别吸取2 μL、3 μL、4 μL、5 μL、6 μL、7 μL，按色谱条件进样，测定色谱峰面积，以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，拟合得回归方程：y=674.73x-24.764，R=0.9995，线性范围为0.70～2.45 μg。

图1 混合对照溶液(a)和样品溶液(b)的HPLC图谱

分别吸取7 μL、9 μL、11 μL、15 μL、17 μL、19 μL鞣花酸母液，按色谱条件进样，测定色谱峰面积，以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，拟合得回归方程：y=2182.8x-41.982，R=0.9996，线性范围为0.56～1.52 μg。

2.4 精密度实验

准确吸取没食子酸对照母液4 μL、鞣花酸对照母液7 μL，分别连续进样6次，测定峰面积，结果见表1。

表1 精密度实验结果

Tab.1 Results of precision experiment

序号没食子酸峰面积平均峰面积RSD/%鞣花酸峰面积平均峰面积RSD/%11173.01855.321144.21843.131177.41169.21.181851.21833.51.0241176.41813.551181.61814.161162.61823.9

由表1可知，没食子酸峰面积的RSD为1.18%、鞣花酸峰面积的RSD为1.02%。表明，仪器精密度良好。

2.3 稳定性实验

准确称取200 ℃热解没食子药渣生物炭粉末，按1.3.2制备样品溶液，按色谱条件分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h进样2 μL，测定没食子酸、鞣花酸的峰面积，结果见表2。

由表2可知，没食子酸和鞣花酸峰面积的RSD分别为0.98%和1.19%。表明，样品溶液在48 h内稳定。

表2 稳定性实验结果

Tab.2 Results of stability experiment

时间/h峰面积没食子酸鞣花酸01095.52113.121082.22113.441084.92124.261103.52153.681104.82158.3101101.02157.9121079.52082.1241079.42118.7481100.42125.2RSD/%0.981.19

2.4 重复性实验

准确称取200 ℃热解没食子药渣生物炭粉末6份，按1.3.2制备样品溶液，按色谱条件进样2 μL，测定没食子酸、鞣花酸的峰面积，结果见表3。

表3 重复性实验结果

Tab.3 Results of repeatability experiment

序号没食子酸峰面积平均峰面积RSD/%鞣花酸峰面积平均峰面积RSD/%11045.92051.621031.92113.731019.41132.71.292075.72099.41.4241032.92128.451016.72105.661049.52121.6

由表3可知，没食子酸和鞣花酸峰面积的RSD分别为1.29%和1.42%。表明，该方法重复性良好。

2.5 加标回收率实验

准确称取6份200 ℃热解没食子药渣生物炭粉末0.50 g，每份加入没食子酸对照品3.90 mg、鞣花酸对照品2.50 mg，按1.3.2制备样品溶液，按色谱条件进样2 μL，进行含量测定，计算加标回收率，结果见表4。

表4 加标回收率实验结果

Tab.4 Results of adding standard recovery experiment

化合物样品含量mg加入量mg测得量mg加标回收率%平均加标回收率%RSD%3.86 3.90 7.71 98.72 4.04 3.90 8.14 105.13 没食子酸3.86 3.90 7.85 102.31 102.102.143.93 3.90 7.89 101.544.04 3.90 8.08 103.593.96 3.90 7.91 101.282.78 2.50 5.28 100.002.88 2.50 5.36 99.20鞣花酸2.83 2.50 5.33 100.0099.930.392.76 2.50 5.27 100.402.80 2.50 5.30 100.002.96 2.50 5.46 100.00

由表4可知，没食子酸、鞣花酸的平均加标回收率分别为102.10%和99.93%， RSD分别为2.14%和0.39%。

2.6 样品测定

准确称取不同热解温度下得到的没食子药渣生物炭粉末，按1.3.2方法制备样品溶液，按色谱条件进样2 μL，测定没食子酸和鞣花酸的峰面积，计算没食子酸和鞣花酸的残留量，结果见表5。

由表5可知，随着热解温度的升高，200 ℃热解药渣生物炭中没食子酸残留量为39.50 mg·g-1、鞣花酸残留量为24.53 mg·g-1；300～500 ℃热解药渣生物炭中未检出没食子酸，而鞣花酸残留量分别为7.01 mg·g-1、1.02 mg·g-1、0.15 mg·g-1；600 ℃热解药渣生物炭中没食子酸和鞣花酸残留均未检出。表明，厌氧条件下，没食子药渣热解前后的没食子酸和鞣花酸的残留量有一定的差异性，且不同温度热解得到的生物炭中没食子酸和鞣花酸的残留量差别很大。

表5 不同热解温度没食子药渣生物炭中没食子酸和鞣花酸的残留量

Tab.5 Residues of gallic acid and ellagic acid in galla residue biochar prepared at different pyrolysis temperatures

热解温度℃没食子酸残留量/(mg·g-1)RSD/%鞣花酸残留量/(mg·g-1)RSD/%20039.501.1424.531.40300——7.011.07400——1.02 1.04500——0.152.16600————

3 结论

采用高效液相色谱法测定没食子药渣生物炭中没食子酸和鞣花酸的残留量。色谱柱为Agilent Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1 mL·min-1，进样量2 μL，检测波长258 nm。结果表明，没食子药渣生物炭中没食子酸在0.70～2.45 μg范围内线性关系良好(R=0.9995)，平均加标回收率为102.10%，RSD为2.14%；鞣花酸在0.56～1.52 μg范围内线性关系良好(R=0.9996)，平均加标回收率为99.93%，RSD为0.39%。没食子药渣热解前后的没食子酸和鞣花酸的残留量有一定的差异性，且不同温度热解得到的生物炭中没食子酸和鞣花酸的残留量差别很大。该方法具有快速、准确、灵敏度高、重复性好的特点，可用于没食子药渣生物炭的质量控制。