薇甘菊挥发油的化学成分及GC指纹图谱

2020-04-21黄薏佳朱小媚钟碧华宋佳堉王术玲

化学与生物工程 2020年2期

黄薏佳，朱小媚，钟碧华，宋佳堉，王术玲

(广州中医药大学中药学院，广东广州 510006)

薇甘菊(MikaniamicranthaKunth)，也称小花蔓泽兰或小花假泽兰，是原产于中美洲和南美洲的一种菊科多年生草本植物，能攀附在其它灌木或树木上疯狂生长，茎节可以随地生根并进行营养繁殖，对自然生态造成严重危害，被认为是世界十大有害杂草之一[1]。作为一种外来物种，薇甘菊在没有天敌的情况下，在中国的繁殖能力极强，尤其在南方亚热带地区疯狂生长[2-3]。韩诗畴等[4]发现薇甘菊很少出现被昆虫啃咬的现象，推测其挥发油可能含有驱避昆虫或使昆虫拒食的物质。薇甘菊挥发油化学成分主要是单萜类及倍半萜类物质，如β-雪松烯、β-石竹烯、α-草烯等，这些成分被证明对昆虫、植物及微生物有不同程度的生物活性抑制作用。王振华[5]研制了含薇甘菊提取物的驱蚊止痒产品，并申请了专利。作者采用GC-MS法分析薇甘菊挥发油化学成分，采用GC法建立其GC指纹图谱，并测定其中β-石竹烯的含量。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

10批薇甘菊均采自广东省境内。

环己烷，分析纯，麦克林公司；无水硫酸钠，分析纯,天津致远化学试剂有限公司；水杨酸甲酯(批号B21198，纯度≥98%)，上海源叶生物科技有限公司；β-石竹烯(批号B0709AS，纯度≥90%)，大连美仑生物技术有限公司。

5890N-GC型气相色谱仪,南京科捷分析仪器有限公司；Agilent 7890B-5977A型气相色谱-质谱仪，美国Agilent公司；挥发油测定器；电热套；电子秤；分析天平；十万分之一天平。

1.2 GC条件

5890N-GC型气相色谱仪。色谱柱为HP-5毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，载气为氮气，流速1.0 mL·min-1，程序升温：起始温度70 ℃，保持2 min；以2.0 ℃·min-1升温至120 ℃；再以40.0 ℃·min-1升温至160 ℃，保持5 min；然后以5.0 ℃·min-1升温至200 ℃，保持5 min。进样量1 μL，分流进样(1∶30)。

1.3 GC-MS条件

Agilent 7890B-5977A型气相色谱-质谱仪。气相色谱条件：色谱柱为HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，载气为高纯氦气(He)，恒压模式，进样口温度240 ℃，程序升温：起始温度70 ℃，保持2 min；以2.0 ℃·min-1升温至120 ℃；再以40 ℃·min-1升温至160 ℃，保持5 min；然后以5 ℃·min-1升温至200 ℃，保持5 min。进样量0.2 μL。质谱条件:电子轰击(EI)离子源，轰击源70 eV，离子源温度230 ℃，流速1.5 mL·min-1，全扫描监测模式，扫描范围50～550 amu。

1.4 溶液的制备

1.4.1 对照溶液的制备

精密称取β-石竹烯对照品22.675 mg，置于25 mL容量瓶中，加环己烷稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.907 mg·mL-1对照溶液。

1.4.2 内标溶液的制备

精密称取水杨酸甲酯48.175 mg，置于25 mL容量瓶中，加环己烷稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1.927 mg·mL-1内标溶液。

1.4.3 供试溶液的制备

采集新鲜薇甘菊地上部分，去除残根和杂质，洗净，剪碎；精密称取100 g，置于1 000 mL烧瓶中，加入500 mL蒸馏水及5 mL环己烷，自挥发油测定器上端缓慢加水至溢流入烧瓶时为止；连接回流冷凝管；将烧瓶置于电热套中缓缓加热至沸，并保持微沸3 h，待测定器中油量不增加时停止加热；冷却至室温，开启测定器下端活塞，放出全部液体，移入分液漏斗中；用5 mL环己烷洗涤测定器内壁，洗液移入分液漏斗中；振摇，静置分层；取上层，加无水硫酸钠脱水；过滤，用少量环己烷冲洗滤纸，滤液移至10 mL容量瓶中，加环己烷稀释至刻度，即得供试溶液。

2 结果与讨论

2.1 薇甘菊挥发油化学成分的分析

取供试溶液，按1.3条件进样测定GC-MS图谱(图1)，分析薇甘菊挥发油的化学成分，结果见表1。其中8号峰经分析鉴定为β-石竹烯。

图1 薇甘菊挥发油的GC-MS图谱

表1 薇甘菊挥发油的化学成分

Tab.1 Chemical components of volatile oil fromMikaniamicrantha

峰号化学成分保留时间/min相对含量/%1水芹烯3.340.512α-蒎烯3.451.233(-)-柠檬烯5.401.984γ-松油烯6.201.335异松油烯7.206.896(-)-α-荜澄茄油烯19.202.287β-古巴烯21.4132.248β-石竹烯22.8017.089蛇麻烯(α-草烯,α-石竹烯)24.652.6210β-大根香叶烯26.256.8011荜澄茄醇27.104.3512衣兰油27.401.6513β-杜松烯27.952.4314荜澄茄烯28.107.00

2.2 薇甘菊挥发油GC指纹图谱的建立

2.2.1 精密度实验

取同一批薇甘菊样品，按1.4.3方法制备供试溶液，吸取1 μL注入气相色谱仪，按1.2条件连续进样6次，测定GC图谱。计算其相似度RSD为0.05%，表明仪器精密度较好。

2.2.2 重复性实验

取同一批薇甘菊样品6份，按1.4.3方法制备供试溶液，分别吸取1 μL注入气相色谱仪，按1.2条件进样，测定GC图谱。计算其相似度RSD为0.6%，表明该方法重复性较好。

2.2.3 稳定性实验

取同一批薇甘菊样品6份，按1.4.3方法制备供试溶液，分别静置0 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h后吸取1 μL注入气相色谱仪，按1.2条件进样，测定GC图谱。计算其相似度RSD为1%，表明供试溶液在6 h内稳定性较好。

2.2.4 薇甘菊挥发油的GC指纹图谱

将采集的10批薇甘菊样品，分别按1.4.3方法制备供试溶液，按1.2条件进样，测定GC图谱。通过相似度软件校正配对，得到10批薇甘菊挥发油的GC指纹图谱叠加图，如图2所示。

图2 10批薇甘菊挥发油的GC指纹图谱叠加图

将10批薇甘菊挥发油的GC数据分别导入“中药指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件，得到10批薇甘菊挥发油的GC指纹图谱共有模式，如图3所示。

图3 10批薇甘菊挥发油GC指纹图谱共有模式

由图3可知，10批薇甘菊挥发油的GC指纹图谱有19个共有峰，相似度为0.80～0.95。

2.3 薇甘菊挥发油中β-石竹烯的含量测定

2.3.1 线性关系考察

精密吸取0.907 mg·mL-1β-石竹烯对照溶液1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，精密加入1.927 mg·mL-1水杨酸甲酯内标溶液1 mL，用环己烷稀释至刻度，摇匀。吸取1 μL，按1.2条件进样，测定GC图谱(图4)。以β-石竹烯浓度(x)为横坐标、β-石竹烯与水杨酸甲酯的峰面积比(y)为纵坐标，绘制标准曲线，拟合得线性回归方程y=8.6117x+0.113，相关系数R>0.9999。表明，β-石竹烯在0.097 2～0.456 3 mg·mL-1范围内与峰面积比呈良好线性关系。

2.3.2 校正因子的测定

精密吸取0.181 4 mg·mL-1β-石竹烯对照溶液1 μL，按1.2条件连续进样6次，计算校正因子平均值为0.562 4(RSD=1.8%)。表明，仪器的精密度良好。

2.3.3 重复性实验

按1.4.3方法制备供试溶液，精密加入1.927 mg·mL-1水杨酸甲酯内标溶液1 mL，用环己烷稀释至刻度，摇匀。吸取1 μL，按1.2条件进样6次，计算β-石竹烯平均含量为0.00268%，RSD为4.7%。表明，该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性实验

按1.4.3方法制备供试溶液，分别静置0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后进样分析，测定β-石竹烯和水杨酸甲酯的峰面积比，计算RSD为1.4%。表明，供试溶液在5 h内稳定。

图4 β-石竹烯对照品(a)和薇甘菊挥发油(b)的GC图谱

2.3.5 加标回收率实验

精密称取薇甘菊样品50 g，置于1 000 mL烧瓶中，加入0.272 1 mg·mL-1β-石竹烯对照溶液5 mL，500 mL蒸馏水自挥发油测定器上端缓慢加入至溢流入烧瓶时为止，按1.4.3方法制备供试溶液，精密加入1.927 mg·mL-1水杨酸甲酯内标溶液1 mL，加环己烷稀释至刻度，摇匀。吸取1 μL，按1.2条件进样6次。计算加标回收率在100%～110%之间，平均加标回收率为105%，RSD为5%。

2.4 讨论

本实验分析得到的薇甘菊挥发油化学成分及含量与文献报道有一定差异，而且所采集的10批样品的GC指纹图谱相似度也存在差异，说明外来物种薇甘菊在新环境下特别是在胁迫条件下往往产生和释放更多种类和更高浓度的次生物质[6]。同时，薇苷菊挥发油化学成分与产地、采收期、光照条件有关，鲜品薇苷菊挥发油与干品薇苷菊挥发油的化学成分也有所不同。比如，林荫下的薇甘菊比被太阳直射的路边薇甘菊的挥发油成分含量普遍偏低，甚至缺少某些成分；老枝薇甘菊比嫩枝薇甘菊的挥发油成分含量更高。另外，提取时间也会影响薇苷菊挥发油化学成分。本实验对比了加热提取5 h和3 h对薇甘菊挥发油化学成分含量的影响，结果表明，加热时间5 h，14号峰(荜澄茄烯)含量减少甚至消失，5号峰(异松油烯)含量明显增加。与文献[7]报道一致，故本实验选择加热提取时间为3 h。