近平滑假丝酵母ATCC 7330对不同取代基乙酮类底物的催化效果

刘 云,王 伟,郭金玲,任立伟,罗华军,余华顺,戴秋红,姚 鹃,龚大春*

(1.三峡大学 湖北省生物酵素工程技术研究中心，湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司酶制剂事业部，湖北 宜昌 443002)

生物催化中常用的有机体是微生物，其本质是利用微生物细胞内的酶进行催化[1-3]。生物催化法反应条件温和，催化过程具有高度的区域、化学和立体选择性，是国内外手性制备的主要方法[4-9]。近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)整细胞或其来源的羰基还原酶(carbonyl reductase)在消旋体醇类化合物的去消旋化、前手性酮或烯胺的不对称还原、消旋体醇类物质的动力学拆分等方面的手性羟基或手性胺药物研究与开发中得到广泛应用[10-11]。Chadha等[12]高度评价了近平滑假丝酵母的生物催化应用价值，把近平滑假丝酵母及其来源的酶作为有机合成中生物催化的一种“试剂”。在合适的反应介质中，近平滑假丝酵母ATCC 7330羰基还原酶(CpCR)能够不对称催化乙酮类物质还原生成R或S型甲基醇[12-18]。CpCR的蛋白质空间结构已经被解析，其蛋白编号为4OAQ，其结构如图1所示。

图1 CpCR的结构

目前，国内对近平滑假丝酵母ATCC 7330整细胞催化的底物研究较少[19-20]。鉴于此，作者设计10种不同取代基的乙酮类底物，通过计算机模拟预测和实验验证，研究近平滑假丝酵母ATCC 7330整细胞催化的底物适应性，以期为该菌株更好应用于生物催化领域奠定基础。

1 实验

1.1 菌株、试剂与仪器

近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)ATCC 7330，实验室保藏。

葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；蔗糖、乳糖、木糖，天津科密欧化学试剂有限公司；标准品：1-苯乙醇、1-(1H-茚-4-基)乙醇、1-(1-萘基)乙醇、对氯苯乙醇、邻氯苯乙醇、对氨基苯乙醇、邻氨基苯乙醇、环丙基乙醇、环戊基乙醇、1-环己基乙醇、苯乙酮、1-(1H-茚-4-基)乙酮、1-萘乙酮、对氯苯乙酮、邻氯苯乙酮、对氨基苯乙酮、邻氨基苯乙酮、环丙基乙酮、环戊基乙酮、环己基乙酮，武汉药明康德公司。所有试剂均为分析纯。

VS-1300L-U型超净工作台，苏净安泰；UV1800型紫外分光光度计，日本岛津；ZQLY-180型振荡培养箱，上海知楚仪器；4L发酵罐，上海保兴生物设备工程有限公司；DHP-9052型电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司。

1.2 培养基

种子培养基(g·L-1)：蔗糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20。

固体培养基(g·L-1)：蔗糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20，琼脂15。

斜面保藏培养基(g·L-1)：蔗糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20，琼脂20。

1.3 方法

1.3.1 CpCR与不同取代基乙酮类底物对接的仿真模拟与预测

利用Discovery Studio 2017版软件，将CpCR分别与自行设计的10种不同取代基乙酮类底物(图2)进行CDOCKER对接，计算这些乙酮类底物和CpCR的结合能和相互作用能，用于预测近平滑假丝酵母ATCC 7330整细胞的底物适应性和催化能力。

1.3.2 菌株的发酵培养

平板培养：接种后的斜面置于28 ℃恒温培养箱中培养48 h。

种子培养：平板培养液接种到装液量20%的摇瓶中，于28 ℃培养24 h。

发酵培养：种子液以10%接种量接种至摇瓶或发酵罐中，于28 ℃振荡培养。

图2 10种不同取代基乙酮类底物的化学结构式

1.3.3 整细胞催化剂的制备

将长势良好的斜面菌种挑取 1 环，接种于固体培养基中，28 ℃培养24 h；经多次转接活化后挑选生长良好的单菌落接种于种子培养基中，于28 ℃、200 r·min-1培养 24 h；将种子液以10%的接种量接种于装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，于28 ℃、200 r·min-1培养48 h；将发酵液于4 ℃、4 500 r·min-1离心，并用生理盐水洗涤3次后收集细胞，即得整细胞催化剂。

1.3.4 整细胞催化过程

反应介质和萃取剂根据底物和产物的极性特点来确定。将6.5 g湿细胞置于32.5 mL磷酸缓冲溶液(pH值6.5,10 mmol·L-1)中，制得细胞悬浮液；取0.1 g底物用1.5 mL丙酮溶解，加入到细胞悬浮液中；28 ℃、150 r·min-1培养一定时间后，用3×50 mL乙酸乙酯(环丙基乙酮用3×50 mL乙醚)萃取，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发浓缩，定容在容量瓶中，备用。

1.3.5 整细胞催化产物的分离

1-(1H-茚-4-基)乙醇、环丙基乙醇、环戊基乙醇、1-环己基乙醇采用气相色谱柱DB-wax分离(汽化室温度250 ℃,检测器温度250 ℃,柱温350 ℃,氮载气流速1.0 mL·min-1)。紫外吸收比较强的物质1-苯乙醇、1-(1-萘基)-乙醇、对氯苯乙醇、邻氯苯乙醇、邻氨基苯乙醇、对氨基苯乙醇等采用高效液相色谱柱OB-H分离(流动相为正己烷∶异丙醇=9∶1，柱温30 ℃，紫外检测波长254 nm，进样量10 μL)。

1.3.6 化学收率、光学收率和催化剂周转数的计算

化学收率和光学收率：采用外标法定量检测醇类产物。

催化剂周转数：1 mol整细胞催化剂1 s催化转化底物的摩尔数。用来表征催化剂的催化能力，催化剂周转数越大，催化能力越强。

以苯乙酮转化为苯乙醇为例，化学收率、光学收率、催化剂周转数的计算如下：

(1)

(2)

(3)

式中：酶(CpCR)分子量为41 kDa，酶用量为10 mg。

2 结果与讨论

2.1 CpCR与10种不同取代基乙酮类底物结合能力的模拟计算

近平滑假丝酵母ATCC 7330整细胞作为一种生物催化剂，能够催化还原各种有机酮类化合物生成手性羟基化合物。利用Discovery Studio 2017版软件，将CpCR分别与自行设计的10种不同取代基乙酮类底物进行模拟对接，计算结合能和相互作用能，结果见表1。

表1 CpCR与10种不同取代基乙酮类底物的结合能和相互作用能/(kJ·mol-1)

Tab.1 The docking energy and interaction energy of CpCR combined with ten ethyl ketone substrates with different substituted groups/(kJ·mol-1)

项目芳环取代基ⅠⅡⅢ带不同取代基的苯环取代基ⅣⅤⅥⅦ脂环取代基ⅧⅨⅩ结合能-13.9220.17-1.39-14.34-12.43-19.41-12.730.760.9114.74相互作用能-16.66-15.87-17.27-17.06-19.9-23.68-14.18-9.45-20.3-2.62

从表1可以看出：

(1)CpCR与3类10种不同取代基乙酮类底物模拟对接的结合能差异较大。除了受空间位阻影响的1-(1H-茚-4-基)乙酮(Ⅱ)外，电子云密度高的芳环取代(包括带不同取代基的苯环取代)乙酮类底物的结合能比电子云密度低的脂环取代乙酮类底物低得多，前者结合能为负值，比较容易发生催化还原反应；而后者结合能为正值，催化还原难度加大。表明近平滑假丝酵母ATCC 7330整细胞对芳环取代乙酮类物质的光学选择性优于脂环取代乙酮类底物。

(2)CpCR与同类不同取代基乙酮类底物模拟对接的对接能差异也较大。对于芳环取代基，其与CpCR的结合能大小依次为Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ，可以预测在CpCR大基团口袋区域中苯乙酮(Ⅰ)最容易被还原，而1-(1H-茚-4-基)乙酮(Ⅱ)由于空间位阻效应较难与CpCR结合，被还原的难度最大；对于带不同取代基的苯环取代基，其与CpCR的结合能大小依次为Ⅴ>Ⅶ>Ⅳ>Ⅵ，对位取代苯乙酮比邻位取代苯乙酮更容易被还原，其中对氨基苯乙酮(Ⅵ)最容易被还原；对于脂环取代基，结合能均为正值，说明脂环取代乙酮类底物电子云密度大大降低，使得CpCR对其适应性大大降低，导致光学选择性降低。

(2)CpCR与3类10种不同取代基乙酮类底物模拟对接的相互作用能均为负值，可以预测近平滑假丝酵母ATCC 7330整细胞对10种不同取代基乙酮类底物均有一定的催化能力。

2.2 近平滑假丝酵母ATCC 7330对10种不同取代基乙酮类底物的催化效果(表2)

表2 近平滑假丝酵母ATCC 7330对10种不同取代基乙酮类底物的催化效果

Tab.2 Catalytic effect ofCandidaparapsilosisATCC 7330 on ten ethyl ketone substrates with different substituted groups

编号底物名称分子量最佳转化时间/h化学收率/%光学收率/%催化剂周转数/s-1Ⅰ 苯乙酮120.07292.9799.991.56×105Ⅱ1-(1H-茚-4-基)乙酮158.048100.00 98.80 1.88×105Ⅲ1-萘乙酮170.01298.7999.906.96×105Ⅳ对氯苯乙酮154.61299.0099.008.80×105Ⅴ邻氯苯乙酮154.61299.0099.008.80×105Ⅵ对氨基苯乙酮135.02495.12100.004.40×105Ⅶ邻氨基苯乙酮135.04887.0079.221.92×105Ⅷ环丙基乙酮84.012064.1863.000.92×105Ⅸ环戊基乙酮112.248100.0057.002.68×105Ⅹ环己基乙酮126.22453.1285.112.52×105

从表2可以看出：

(1)对于3种芳环取代乙酮类底物(Ⅰ～Ⅲ)，近平滑假丝酵母ATCC 7330整细胞催化产物构型均为R型，可实现较高的化学收率和光学收率，其中1-(1H-茚-4-基)乙酮的化学收率最高；近平滑假丝酵母ATCC 7330对3种芳环取代乙酮类底物的催化能力大小依次为Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ，与底物的芳环电子云密度大小顺序正好一致，说明芳环取代乙酮类底物的电子云密度越大，整细胞的催化效果越好；从光学收率看，苯乙酮和1-萘乙酮均能得到99.90%以上的光学纯度，与结合能预测一致。

(2)对于4种带不同取代基的苯环取代乙酮类底物(Ⅳ～Ⅶ)，近平滑假丝酵母ATCC 7330整细胞对氯取代苯乙酮的催化效果较对氨基取代苯乙酮的催化效果好，这可能是因为，氯对苯环的共轭效应贡献较大，使得羰基上氧的电子云密度较大，从而提高了整细胞催化效率；近平滑假丝酵母ATCC 7330整细胞对邻氨基取代苯乙酮的催化效果较差，光学收率也较低，这可能与邻氨基取代苯乙酮与CpCR模拟对接时的相互作用能较高有关；对氨基苯乙酮、对氯苯乙酮、邻氯苯乙酮与CpCR模拟对接时的结合能均较低，其产物光学收率均达到99.00%以上，与结合能预测一致，但邻氨基苯乙酮表现出中等的化学收率和光学收率，其原因还在进一步研究中。

(3)对于3种脂环取代乙酮类底物(Ⅷ～Ⅹ)，光学收率均较低(57.00%～85.11%)，说明近平滑假丝酵母ATCC 7330对脂环取代乙酮类底物的适应性较差，与预测的结合能较高(为正值)一致；从化学收率和催化剂周转数来看，近平滑假丝酵母ATCC 7330对环戊基乙酮的催化效果较好。

3 结论

从近平滑假丝酵母ATCC 7330对3类10种不同取代基乙酮类底物的催化效果可以看出，近平滑假丝酵母ATCC 7330整细胞催化对芳环取代乙酮类底物的光学选择性优于脂环取代乙酮类底物，对氨基苯乙酮的光学选择性最高，与模拟对接预测的结合能大小一致；从催化剂周转数来看，近平滑假丝酵母ATCC 7330整细胞对10种不同取代基乙酮类底物的催化能力大小依次为对氯苯乙酮=邻氯苯乙酮>1-萘乙酮>对氨基苯乙酮>环戊基乙酮>环己基乙酮>邻氨基苯乙酮>1-(1H-茚-4-基)乙酮>苯乙酮>环丙基乙酮，与对接模拟预测有一定差距，说明近平滑假丝酵母ATCC 7330整细胞的催化能力除了与结合能有关外，还与细胞的渗透性、反应溶剂等因素有关，需要做进一步研究。